Tregs對同種異體牙移植免疫排斥反應(yīng)的抑制作用﹡

金光春 陳從容 李言君 薛江南 姜 玲 李升鐘 金東春

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺264003；2.韓國延世大學(xué)，首爾120-752；3.延邊大學(xué)，吉林延吉133000））

目前，異體牙移植作為一種器官移植，因免疫排斥問題未得到解決，至今仍有許多問題有待探索。近年來，隨著器官移植和免疫抑制劑研究的進展，動物實驗已取得了成功。隨著手術(shù)技巧的成熟和圍手術(shù)期處理等方面的日益完善，異體牙移植已成為多種實質(zhì)性器官終末期疾病的有效治療手段。盡管各種新的免疫抑制劑不斷問世，但移植后的排斥反應(yīng)仍無法完全避免[1-3]。如何消除或降低異體牙移植后的免疫排斥反應(yīng)，提高異體牙移植的成功率，是臨床上亟待解決的問題。而且研究報告不盡相同，尚無統(tǒng)一的定論[6]。本研究針對異體牙移植免疫排斥反應(yīng)，探求新的、安全有效的新型免疫抑制劑，為異體牙移植術(shù)在臨床上提供基本資料。

1 對象與方法

1.1 實驗對象與實驗組

經(jīng)過血液抗原性確認的20只白鼠（4周齡的Sprague-Dawley系）隨機分為兩組，同種異體移植組和接受組，選擇15只雄性白鼠（30顆上頜左右第1磨牙）為異體牙供者，體重16～20g。選擇15只雌性白鼠（20顆上頜左右第1磨牙）為移植牙受體者，體重16～18g，分成具有相同抗原性和不同抗原性兩類。1組：免疫抑制劑未處理，分別1周、2周、4周、8周時間段采集實驗標本。2組：免疫抑制劑（Tregs）處理，分別1周、2周、4周、8周時間段采集實驗標本。保存溶液采用F medium。靶細胞采用Sp-20骨髓瘤細胞。

1.2 生物化學(xué)試劑、反應(yīng)試劑及免疫抑制劑的應(yīng)用

[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2.5-diphenylte-trazolium bromede，MTT]

溴化二苯四偶氮鹽，兔補體，蛋白水解酶。反應(yīng)試劑是采用10% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO/Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA）。術(shù)前1天晚和術(shù)前20分鐘依據(jù)實驗分組給予免疫抑制劑1次。

1.3 方法

1.3.1 牙移植術(shù) 采用Ketamine（0.1mL/100gm，Jaeil JaeDang，Korea）藥物麻醉后，用探針進行牙周分離，盡量減少對周圍組織外傷的情況下，用特制的拔牙鉗子拔除異體牙供者的左右上頜第1磨牙，移植于受體者。

1.3.2 效應(yīng)細胞的制備 無菌條件下取出同種異體移植組和接受組白鼠脾臟在骨鑿器上磨碎，收集益出的淋巴細胞，使用60% Pecoll充分的分離淋巴細胞。

1.3.3 組織學(xué)觀察 1、2、4、8周時間段進行牙移植術(shù)后，處死動物，摘除頜骨，10%福爾馬林固定24h，在5%硝酸脫敏溶液中脫敏5d。以牙齒長軸1mm的間隔垂直切片，制備5μm標本，用Hematoxylin-eosin染色并觀察牙根吸收程度及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)。光鏡下觀察各組標本的免疫排斥反應(yīng)的程度。排斥反應(yīng)依據(jù)Muram[7]的分類分為4級：0級-無排斥反應(yīng)；1級-輕度反應(yīng)；2級-中度反應(yīng)；3級-重度反應(yīng)。對各組各時間段的病理學(xué)標本進行分級分析，觀察各組的免疫抑制效果。

1.3.4 細胞免疫學(xué)觀察 使用流式細胞儀計數(shù)檢測各組受體血清中T淋巴細胞亞群CD4+和CD8含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

同種異體移植牙術(shù)后1周開始觀察大多數(shù)牙根吸收及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)牙根周圍引流的免疫細胞反應(yīng)。在牙根周圍的單核細胞浸潤及局部淋巴結(jié)內(nèi)淋巴母細胞的產(chǎn)生。移植牙受體區(qū)域纖維血管組織長入，根尖周圍牙周韌帶細胞大量破壞，組織血管吸收、壞死，大量的炎細胞浸潤。分布于骨質(zhì)表面，形成骨吸收窩陷。免疫抑制劑未處理的實驗組術(shù)后1周可持續(xù)增加排斥反應(yīng)，植片平均存活時間為（16.82±2.34）d，4周達到頂峰。免疫抑制劑處理的實驗組術(shù)后2周開始出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，至術(shù)后2周達到頂峰。植片觀察炎細胞浸潤，伴有新生血管長入牙槽骨周圍，組織切片存活時間顯著的延長，為(40.52±1.23)d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。牙根吸收程度及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，見圖1～4。

圖1 1組：1～2周（HE×100）

圖2 2組：1～2周（HE×100）

圖3 1組：4～8周（HE×100）

圖4 2組：4～8周（HE×100）

2.2 免疫排斥反應(yīng)分析

免疫檢測結(jié)果表明同種異體移植接受組組織切片CD8+T細胞產(chǎn)生數(shù)量不如CD4+T細胞多，其表達強度明顯高于CD8+T細胞陽性細胞。同種異體移植組未觀察CD8+T細胞，大部分收集于移植周圍區(qū)域，見表1。術(shù)后4周和8周兩組檢測值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組不同時間CD4+T與CD8+T變化（±s，d）

表1 各組不同時間CD4+T與CD8+T變化（±s，d）

分組 1周 2周 4周 8周1組 86.82±16.27 78.23±9.23 70.88±7.67 32.13±5.39 2組 65.12±23.15 56.05±10.41 59.52±6.55 15.62±4.44

2.3 病理觀察

1組與2組不同時間段比較，2組病理學(xué)觀察明顯低于1組（P＜0.05），說明抑制劑對同種異體牙移植術(shù)后排斥反應(yīng)的抑制作用。

表2 各組不同時間移植排斥反應(yīng)變化

3 討論

異體牙移植面臨的一個難題是移植后的排斥反應(yīng)。因此，研究異體牙移植免疫排斥反應(yīng)的病理過程及發(fā)病機制，尋找有效的預(yù)防具有重要意義。

從目前文獻報道來看，動物異體牙移植實驗或臨床異體牙移植病例的成功率約9.6%～83.0%[8-9]。對于異體牙移植排異反應(yīng)的研究，國外學(xué)者大多采用非特異性檢測方法，主要有：（1）宿主對來自同一供體的“二次皮膚移植”的加速排斥反應(yīng)；（2）受植區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)中免疫淋巴母細胞的產(chǎn)生。以往的研究認為異體牙牙周膜組織所致的移植免疫反應(yīng)是導(dǎo)致牙根吸收、影響移植牙存活率和存活時間的重要因素[10]。

目前人們常通過選擇和處理異體牙的組織相容性配型試驗來消除或降低異體牙移植的免疫排斥反應(yīng)。常用的決定受體組織配型方法是ABO血型相容性試驗、HLA分型試驗及組織相容性交叉試驗。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)供受體組織相容性抗原一致的異體牙在移植后1年存活率為85%，而組織相容性抗原不同的異體牙移植后1年存活率只有31%。

免疫抑制劑的使用是抑制同種異體牙移植免疫排斥反應(yīng)，保證移植術(shù)成功的標準之一。尋找較低毒無害的免疫抑制方法也是目前實驗研究的重點。為有效抑制排斥反應(yīng)，在異體移植后應(yīng)用Tregs的方案，在異體牙移植術(shù)中顯示了良好的效果。Vossen 等[12]用豬同種異體肢體移植模型實驗，確定了免疫抑制方法的可行性，并提出了好的建議。為研究同種異體牙移植的免疫抑制方法和移植術(shù)的改進，本研究采用了實驗組免疫抑制劑未處理、免疫抑制劑（Tregs）處理，分別1、2、4、8周時間段采集實驗，對比觀察免疫排斥反應(yīng)、術(shù)后植片存活率等。結(jié)果同種異體移植牙術(shù)后1周開始出現(xiàn)牙根吸收及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，觀察牙根周圍的單核細胞浸潤及局部淋巴結(jié)內(nèi)淋巴母細胞的產(chǎn)生。移植牙受體區(qū)域纖維血管組織長入，根尖周圍牙周韌帶細胞大量破壞，組織血管吸收、壞死，大量的炎細胞浸潤。分布于骨質(zhì)表面，形成骨吸收窩陷。免疫抑制劑未處理的實驗組術(shù)后1周可持續(xù)增加排斥反應(yīng)，植片平均存活時間為（16.82±2.34）d，4周達到頂峰。免疫抑制劑處理的實驗組術(shù)后2周開始出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，至術(shù)后2周達到頂峰。植片觀察炎細胞浸潤，伴有新生血管長入牙槽骨周圍，組織切片存活時間顯著延長（P＜0.01），為（40.52±1.23）d。免疫檢測結(jié)果表明同種異體移植接受組組織切片CD8+T細胞產(chǎn)生數(shù)量不如CD4+T細胞多，其表達強度明顯高于CD8+T細胞陽性細胞。同種異體移植組未觀察CD8+T細胞，大部分收集于移植周圍區(qū)域。術(shù)后4周和8周兩組檢測值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，證明Tregs免疫抑制方法在同種異體牙移植中可以取得有效的免疫抑制效果。

Coutinho等[13]提出CD4+T細胞和CD8+T細胞介導(dǎo)的細胞與移植排異反應(yīng)有密切聯(lián)系。CD4+T細胞和CD8+T能改變免疫抑制功能異常地指標，其值也代表了試驗的免疫穩(wěn)定，而且所測的指標可較好地檢測免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。在本研究免疫組化觀察中，CD4+T細胞表達明顯高于CD8+T細胞，分析異體牙移植免疫反應(yīng)發(fā)生是依靠于CD4+T細胞介導(dǎo)反應(yīng)，此結(jié)果與本試驗研究結(jié)果基本相符，說明CD4+T細胞和CD8+T值可以檢測免疫抑制的效果。

異體牙來源豐富，如果找到消除異體牙移植術(shù)后并發(fā)癥的免疫排斥反應(yīng)的抑制方法，延長異體牙移植術(shù)后供體的存活時間，抑制免疫排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)供體免疫耐受，將提高異體牙移植術(shù)的成功率，今后有待于深層的研究。本研究針對異體牙移植免疫排斥反應(yīng)，探求新的、安全有效的新型免疫抑制劑，為異體牙移植術(shù)在臨床上提供基本資料。

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