抗稻瘟病幾丁質酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件的研究

唐勇軍,盧向陽,鄒 俊,田 云

(1.湖南工程學院化學化工學院,湘潭 411104;2.湖南農(nóng)業(yè)大學生化與發(fā)酵工程室,長沙 410128;)

抗稻瘟病幾丁質酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件的研究

唐勇軍2,盧向陽1,鄒 俊2,田 云1

(1.湖南工程學院化學化工學院,湘潭 411104;2.湖南農(nóng)業(yè)大學生化與發(fā)酵工程室,長沙 410128;)

稻瘟病具有傳染快、危害大等特點,其微生物防治具有良好的發(fā)展前景.本實驗采用以稻瘟病細胞壁為篩選培養(yǎng)基來篩選抗稻瘟病的幾丁質酶產(chǎn)生菌,并對篩選到的優(yōu)良菌株進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化.實驗結果表明,從不同來源的土壤和植物器官中分離得到16株能檢測到幾丁質酶活性的幾丁質酶產(chǎn)生菌,其中以H3和H9的產(chǎn)酶能力最強,具有良好的開發(fā)價值.

幾丁質酶產(chǎn)生菌;篩選;產(chǎn)酶條件;稻瘟病

稻瘟病是水稻三大病害之一,被稱為水稻"癌癥",有傳染快、危害大及防治難的特點,可以引起水稻大幅減產(chǎn),嚴重時可以達到40%～50%,甚至絕收.雖然部分化學農(nóng)藥對稻瘟病的防治有一定的效果,但是由于環(huán)境污染嚴重不宜過量施用,而且化學農(nóng)藥容易引起病菌的抗藥性而導致病菌失控,因此生物農(nóng)藥和生物防治是未來發(fā)展的主要方向.幾丁質(chitin),也稱為甲殼素、甲殼質等.它在自然界中分布廣泛,儲量非常豐富.幾丁質酶(chitinase,EC3.4.1.14)可催化水解幾丁質的β-1,4糖苷鍵生成幾丁聚糖和幾丁寡糖[1].由于許多的病原微生物和有害昆蟲體內(nèi)含有幾丁質,因此幾丁質酶作為幾丁質的降解酶,它在植物病蟲害防治,尤其在真菌病害的防治中有很重要的應用價值.研究證明,幾丁質的降解產(chǎn)物-幾丁寡糖能誘導啟動植物的防御系統(tǒng),刺激植物生長發(fā)育[2].幾丁質酶產(chǎn)生菌是一類能夠利用幾丁質為碳源而生長的微生物,其共同特征就是能夠分泌幾丁質酶,并通過這些酶的作用將幾丁質降解為幾丁質寡糖和幾丁質單糖[3].自從Benecke首次報道分離到幾丁質酶產(chǎn)生菌以來,發(fā)現(xiàn)在微生物中很多細菌、放線菌、真菌、酵母及某些病毒能夠產(chǎn)生幾丁質酶.盡管國內(nèi)研究工作者在幾丁質酶產(chǎn)生菌篩選方面做了大量工作,但以稻瘟病細胞壁為篩選基質來篩選抗稻瘟病幾丁質酶產(chǎn)生菌方面的文獻尚未見報道.本實驗利用改良的篩選方法從自然界中分離篩選得到了兩種產(chǎn)幾丁質酶和降解稻瘟病細胞壁能力較強的幾丁質酶產(chǎn)生菌,并對這兩株菌株進行了產(chǎn)酶條件的研究.

1 實驗部分

1.1 細粉幾丁質的制備

把條狀幾丁質置在烘箱中80℃下烘烤2d,用粉碎機粉碎再過60目篩.

1.2 膠體幾丁質的制備

參照中國科學院上海植物生理研究所和上海市植物生理學會主編的《現(xiàn)代植物生理學實驗指南》[4].

1.3 稻瘟病病原菌細胞壁懸浮物制備及菌株篩選

用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病病原菌,20℃振蕩培養(yǎng)3～4天后收集菌體,將菌塊剪碎,加液氮冷凍后充分碾磨,破碎細胞,然后用水洗去細胞內(nèi)容物制成細胞壁懸浮物[5].

1.4 幾丁質酶活性測定

取在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后的培養(yǎng)液,在2500×g下離心 15 min.取上清夜 1 mL,加入 0.1 mol/L,pH7.0的磷酸緩沖液(含1%膠體幾丁質)1 mL,在 37 ℃下保溫1小時,加DNS試劑2 mL,在沸水浴中保溫10 min.冷至室溫后,在1500×g下離心8 min.在OD530比色,計算NAG的量.

酶活力定義:在上述條件下,每小時釋放1000 μ g NAG的酶量為一個酶活力單位[6].

1.5 菌種最適產(chǎn)酶條件的研究方法

以分離培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,在不同的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH、培養(yǎng)氮源、培養(yǎng)碳源條件下?lián)u床培養(yǎng)H3和H9菌株,檢測幾丁質酶活性[8].

2 結果與分析

2.1 幾丁質酶產(chǎn)生菌菌種的篩選

將各種土壤(棉田土、稻田土、桔園土、菜園土、池塘底泥、水產(chǎn)養(yǎng)殖場的泥土等)和植物器官(根、莖、葉)中樣品,在以幾丁質為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中培養(yǎng).得到16個能在上述分離培養(yǎng)基中生長的菌株.編號分別為H1-H16.將 H1-H16菌株繼續(xù)培養(yǎng),根據(jù)產(chǎn)生透明圈的大小選出7個較好的菌株,分別為 H2、H3、H5 、H7、H9、H12 、H13.其中 ,圖1所示為H3菌株和H9菌株在平板培養(yǎng)基上的生長情況.

上述7個菌株都能在以含有稻瘟病病原菌細胞壁成分的培養(yǎng)基上生長,均能檢測得到幾丁質酶活性(見圖2),其中菌株 H3和 H9的酶活性最高,分別是3.4 U/mL和2.9 U/mL.

2.2 菌落形態(tài)觀察

2.2.1 H3菌落的觀察

培養(yǎng)1d后,觀察生長的單個菌落,菌落形態(tài)為不規(guī)則形、呈灰白色、不透明、表面光滑、濕潤,菌落邊緣整齊且不易刮下(見圖1).

2.2.2 H9菌落的觀察

如圖1所示,H9菌株的菌落直徑約為0.5～0.8cm,呈輪狀同心圓形,菌落突出,較干燥,且容易刮落.菌株培養(yǎng)早期菌落呈淡紅色,后轉呈淡青色.光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),H9菌絲為輪枝狀,無隔核,無色.頂端有孢子囊,孢子囊呈球狀.培養(yǎng)4天后,有大量孢子產(chǎn)生.初步認為H9菌株可能是青霉菌.

2.3 菌種產(chǎn)酶條件的研究

2.3.1 最適培養(yǎng)時間

圖3 菌株產(chǎn)酶活力時間進程曲線

取在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d的H3菌株和H9菌株種子培養(yǎng)液按2%接種量接入液體的分離培養(yǎng)基中,25℃,120 r/min下震蕩培養(yǎng).從36 h開始,每隔12 h檢測一次幾丁質酶活力.結果如圖3所示,H3菌株從60 h開始產(chǎn)酶活力增長加快,到72 h時達到最高值.72 h后酶活性逐漸下降.這可能是隨著時間的延長,培養(yǎng)液中產(chǎn)生大量芽孢,營養(yǎng)體生成減少,導致產(chǎn)酶能力下降.H9菌株酶活力增長比較平緩,至84 h時酶活力達到最高,之后緩慢下降.

2.3.2 最適溫度條件

圖4 溫度對菌株產(chǎn)酶活力的影響

取在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d的H3和H9菌株種子培養(yǎng)液,按2%接種量接入分離培養(yǎng)基中,分別在不同的溫度(25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃)下培養(yǎng)72 h和84 h,檢測酶活.結果如圖4所示,H3菌株在30℃時酶活力最高,達到3.82 U/mL.H9菌株在35℃時達到最佳產(chǎn)酶水平,酶活力為3.08 U/mL.

2.3.3 最適pH

將產(chǎn)酶培養(yǎng)基調(diào)至不同的pH,H3菌株在30℃下培養(yǎng)72 h,H9菌株在35℃下培養(yǎng)84 h,測得幾丁質酶酶活性如圖5所示.H3菌株在pH6.5之前幾丁質酶酶活力增長平緩,pH6.5以后酶活力顯著增長,在pH7.2時酶活力最高,達3.9 U/mL.H9菌株在pH6.9左右到達最高值.H3和H9最適pH均接近中性,按邱立友方法分類[9],它們分泌的幾丁質酶均屬于中性幾丁質酶.

圖5 pH對菌株產(chǎn)酶活力的影響

2.3.4 最適氮源

圖6 氮源對菌株產(chǎn)酶活力的影響

以細粉幾丁質為唯一碳源,分別在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和硝酸銨為氮源,H3菌株在30℃、pH7.2下培養(yǎng)72 h,H9菌株在35℃、pH6.9下培養(yǎng)84 h.發(fā)現(xiàn)酵母膏和蛋白胨等有機氮源是H3比較適合的氮源,其中以酵母粉為最佳(圖6).在以酵母粉為氮源的處理中,幾丁質酶活性比兩種無機氮源的處理提高近一倍.同樣H9也是在有機氮源時達到較理想的產(chǎn)酶水平.這可能是因為幾丁質酶產(chǎn)生菌大都是寄生在含有幾丁質的一些有機物上面,通過降解有機物而生存,因此能更好的利用有機氮源.

2.3.5 最適碳源

以酵母粉為氮源,用不同的碳源(細粉幾丁質、膠體幾丁質、葡萄糖、淀粉、蔗糖)進行產(chǎn)酶實驗,H3菌株在30℃、pH7.2下培養(yǎng)72 h,H9菌株在35℃、pH6.9下培養(yǎng)84 h.從圖7可以看出,細粉幾丁質和膠體幾丁質能明顯的提高H3和H9的產(chǎn)酶活力,說明H3和H9產(chǎn)生的幾丁質酶是一種底物誘導酶,而細粉幾丁質誘導作用稍優(yōu)于膠體幾丁質.

圖7 碳源對菌株產(chǎn)酶活力的影響

3 討 論

幾丁質是最主要的天然聚合物之一,它廣泛存在于自然界中,它也是多種微生物生長的有效碳源.本試驗通過以幾丁質為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選產(chǎn)幾丁質酶的菌株,發(fā)現(xiàn)在自然界中存在許多能以幾丁質為碳源而生長的微生物.邱立友等[9]從黃淮地區(qū)的部分土壤中檢測到大量的幾丁質酶產(chǎn)生菌,但自然篩選出的菌株只有少數(shù)產(chǎn)酶活力較高.所以說要選擇出產(chǎn)幾丁質酶活力強的優(yōu)良菌株,必須經(jīng)過長期的不懈努力去自然界中篩選,并應對篩選的菌種進行人工誘變,以選育出產(chǎn)酶活性更高的菌株.本實驗室從長沙地區(qū)的一些土壤和植物器官中篩選出16株幾丁質酶產(chǎn)生菌.其中H3菌株和H9菌株具有較高的產(chǎn)酶活力.微生物產(chǎn)生的酶有組成型和誘導型之分.許多研究資料表明,一些大分子物質,對微生物具有誘導作用,誘導微生物產(chǎn)生相應的酶來降解它們.本實驗分離得到的兩株幾丁質酶產(chǎn)生菌在細粉幾丁質和膠體幾丁質誘導下能產(chǎn)生較高活性的幾丁質酶,而以其它物質為碳源時,幾丁質酶活性大大降低.因此可以推斷,H3菌株和H9菌株是誘導型的幾丁質酶產(chǎn)生菌,這一研究結果與國內(nèi)外報道的許多研究結果一致,具有良好的研究價值.成功獲得優(yōu)良菌株只是第一步,盡管實驗證明了這兩株菌株具有良好的產(chǎn)酶表現(xiàn),接下來還需要進一步對菌株改良、鑒定、以及基因分析,并對其抗稻瘟病特性進行鑒定,以獲得能在實踐中應用的產(chǎn)品.

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Studies on Screening and Enzyme-producing Conditions of Chitinase-producing Strain of Anti-rice Blast

TANG Yong-jun2,LU Xiang-yang1,ZOU Jun2,TIAN Yun1
(1.College of Chemistry and Chemical Eng.,Hunan Institute of Engineering,Xiangtan 411104,China;2.Lab of Biochemistry&Fermentation Engineering,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Rice blast has the characteristics of fast infection and great harm,and it＇s microbial control has good prospects.Chitinase producing strains are screened by selective medium which contains rice blast walls.The premium fermentation is selected by optimization experiment.The results show that sixteen chitinase producing strains are screened from soil and plant organs which can detect chitinase activity.H3 and H9 have stronger ability of producing chitinase in all of this strains,and therefore have good value of research and application prospect in the future.

chitinase producing strains;screening;enzyme-producing conditions;rice blast

Q939.9

A

1671-119X(2011)01-0074-04

2010-09-06

湖南省教育廳科研資助項目(06C239)

唐勇軍(1976-),男,碩士,講師,研究方向:天然產(chǎn)物開發(fā).

盧向陽(1962-),男,教授,博士生導師,研究方向:農(nóng)業(yè)生物技術.