類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的相關(guān)細(xì)胞因子研究

李 穎，劉英娜，覃仕化，楊俊生，冷冬妮，王 珺，杜秀鑾，汪 悅

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis，RA)是一種臨床常見的疾病，是一種不明原因的慢性炎性多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，RA 患者的關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)周圍韌帶組織的攣縮、變形是影響RA 患者關(guān)節(jié)置換后功能康復(fù)的重要原因［1］。本研究通過牛Ⅱ型膠原(CⅡ)誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型的韌帶及關(guān)節(jié)囊組織的病理觀察和相關(guān)細(xì)胞因子的研究，探討大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型(CIA)中的韌帶組織的浸潤機制及不同時期的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 材料 Wister 大鼠90 只(上海斯萊克公司提供)，體重180 ～220 g，8 周齡左右，雌雄各半，常規(guī)條件飼養(yǎng)。隨機分成三組:正常組、CIA 組、加強CIA 組各30 只。

1.2 配置CⅡ乳劑 用0.1 ml/L 的冰醋酸先溶解CⅡ，濃度為4 mg/ml，放置4℃冰箱過夜，與弗氏完全佐劑(上海sigma 醫(yī)學(xué)試劑有限公司)等體積混合，震蕩乳化制成CⅡ乳劑，置于4℃冰箱保存。

1.3 造模 將配置好的CⅡ乳劑以0.1 ml/只的劑量注射于大鼠的左足底，加強CIA 組于1 周后原部位再次注射同樣劑量CⅡ乳劑。

1.4 取材 分別于最后一次注射后的第10 天、20天、30 天，分三次處死大鼠，取踝關(guān)節(jié)的韌帶和關(guān)節(jié)囊組織，將所取組織分成兩份，分別行組織勻漿和病理檢查。

1.5 組織勻漿的方法 取新鮮組織洗凈擦拭干凈后立即放入－70℃冰箱中冷凍保存，以備勻漿。勻漿方法如下:稱取一定量的組織，以生理鹽水(生理鹽水的體積總量為組織塊重量的9 倍)混合，倒入勻漿管中充分研碎，使組織勻漿化后，于4℃，3000 r/min 離心10 ～15 min，吸取上清液裝入EP 管，放入－70℃冰箱冷凍保存，待檢。

1.6 病理檢查 取組織標(biāo)本，以4%中性甲醛固定，常規(guī)檢查。

1.7 檢測 對于1.5 步驟所取組織勻漿液，分別用ELISA(上海韻涵生物科技有限公司)試劑盒檢測IL-2 和TNF-α 水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 檢測數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件分析處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用成組t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下觀察 CIA 模型大鼠的韌帶組織病理切片中可見大片炎性滲出及壞死、肉芽組織形成、周圍血管擴張、充血、大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤。加強組的血管擴張及淋巴細(xì)胞浸潤程度較未加強組高，可見淋巴濾泡與纖維素滲出、膠原纖維沉著及纖維素樣壞死。見圖1 ～3。

2.2 大鼠踝關(guān)節(jié)組織勻漿IL-2 與TNFL-α 檢測結(jié)果 CIA 組與加強CIA 組的同期IL-2 及TNF-α 濃度均顯著高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，其中尤以加強CIA 組的表達(dá)最高。CIA 組與加強CIA 組中期的IL-2 與TNF-α 的濃度也顯著分別高于同組的早、晚期，差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 CIA 組:關(guān)節(jié)滑膜組織較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(HE ×40)

圖2 加強CIA 組:較多淋巴細(xì)胞浸潤并見淋巴濾泡形成(HE ×40)

圖3 加強CIA 組:肉芽組織形成伴組織細(xì)胞增生、多核巨細(xì)胞反應(yīng)(HE ×40)

表1 大鼠踝關(guān)節(jié)組織勻漿IL-2 與TNF-α 濃度檢測結(jié)果(ng/L，n=10)

表1 大鼠踝關(guān)節(jié)組織勻漿IL-2 與TNF-α 濃度檢測結(jié)果(ng/L，n=10)

注:與正常組同期比較，*P ＜0.05;與本組早、晚期比較，△P ＜0.05

IL-2TNF-α?xí)r間正常組 CIA 組 加強CIA組 正常組 CIA 組 加強CIA組早期 646.2±50.7 772.0±45.9* 961.6±50.2* 115.02±3.49 159.69±7.09 195.32±5.73*中期 584.8±25.8 890.8±53.2＊△ 1110.8±56.2＊△ 123.44±3.52 210.47±1.33△ 216.10±2.62＊△晚期 644.0±24.8 802.2±71.8* 1015.8±54.7* 126.48±1.52 173.98±4.95 200.40±2.64*

3 討 論

RA 是一種不明原因的慢性炎性多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，病變的特征是持續(xù)性進行性的滑膜炎，通常累及對稱的周圍關(guān)節(jié)［2］?；ぱ啄芤疖浌瞧茐模^而引起關(guān)節(jié)畸形而成為該病的標(biāo)志［3］。RA患者的關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)周圍韌帶組織的攣縮、變形是RA 患者關(guān)節(jié)畸形、功能障礙的重要原因之一［4］?，F(xiàn)代關(guān)節(jié)外科的技術(shù)日漸成熟，RA 對于滑膜和骨組織的破壞，使用外科技術(shù)可以獲得滿意的糾治，但是韌帶和關(guān)節(jié)囊組織的攣縮變形仍是影響關(guān)節(jié)置換術(shù)后的患者功能康復(fù)的重要因素之一［5］。RA 患者的自然病情遷延較長，很難觀察到完整的關(guān)節(jié)囊及韌帶組織病變的過程。研究證實［6］，RA 患者血清及滑膜液中存在抗膠原抗體，這種對膠原組織的自身免疫反應(yīng)，可以解釋其具有的系統(tǒng)性和慢性持續(xù)性發(fā)展的特點。CIA 的病理改變表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的增生、浸潤，能夠較好的反映RA 的韌帶及關(guān)節(jié)囊的浸潤機制，是研究治療RA 的較理想的模型。

研究表明:RA 患者病理切片亦證實了其韌帶與關(guān)節(jié)囊的浸潤過程與血管擴張后的慢性炎性浸潤相關(guān)。TNF-α 作為一個公認(rèn)的炎性因子［7］，廣泛的作用于炎性浸潤的各個過程，在炎性反應(yīng)的局部組織中有較高的表達(dá)，在RA 患者滑膜液中其表達(dá)也較高。TNF-α 在RA 病變中的主要作用［8］:①為強有力的骨吸收刺激劑，其作用是PG 依賴性的，并可抑制骨膠原合成。②刺激成纖維細(xì)胞增殖，刺激成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生PGE2和膠原酶，刺激軟骨細(xì)胞分泌金屬蛋白酶，促進軟骨破壞。③升高纖維蛋白溶酶激活劑的濃度。④增加滑膜內(nèi)皮細(xì)胞合成纖維細(xì)胞生長因子的釋放，促進新血管的形成，這是血管翳增生的一個重要的早期特征。⑤調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的產(chǎn)生。IL-2 作為T 淋巴細(xì)胞活性的標(biāo)志性因子，反映了T 淋巴細(xì)胞的功能水平，具有免疫增強和免疫調(diào)節(jié)作用，在RA 發(fā)病急性期IL-2 水平增高，促進炎癥發(fā)展。

本研究重點關(guān)注RA 的韌帶及關(guān)節(jié)囊組織的病變過程，CIA 模型大鼠的韌帶及關(guān)節(jié)組織的病理變化反映了這種變化趨勢，組織勻漿中的TNF-α 和IL-2 的水平變化也驗證以上結(jié)論。實驗中發(fā)現(xiàn)CIA組與加強CIA 組在20 d 左右的細(xì)胞因子水平最高，隨后則顯現(xiàn)出CIA 模型大鼠炎性過程的自限性趨勢。有文獻(xiàn)指出TNF-α 和IL-2 的表達(dá)水平波動幅度較大，我們考慮這可能與實驗方法的不同、免疫劑量的不同、注射及加強方法的差異、組織取材的時間以及檢測試劑盒選擇不同有關(guān)。CIA 造模的標(biāo)準(zhǔn)實驗方法，有待在大樣本量的實驗基礎(chǔ)上統(tǒng)一。CIA大鼠的病理切片主要的形態(tài)特點是炎性細(xì)胞的彌漫性浸潤，與人的病理切片顯示炎細(xì)胞浸潤主要是以血管擴張，圍繞血管為中心的炎性浸潤方式有一定的區(qū)別，這種區(qū)別主要因發(fā)病機制不同而異，對于炎性轉(zhuǎn)歸有無影響有待進一步的研究。

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