褐藻糖膠脫蛋白及脫色方法研究

陳淑華，張淑平，杜秀秀，周勤生

（上海理工大學(xué)，上海 200093）

褐藻糖膠又名巖藻多糖硫酸酯或巖藻聚糖，是一種含有硫酸酯的水溶性雜聚糖，是褐藻中特有的一種化學(xué)組分[1]。目前，已有研究報道指出，褐藻糖膠具有廣泛的生理活性，如降血脂、抗凝血、抗氧化、免疫、抗腫瘤、抗疲勞等活性，成為目前海洋藥物開發(fā)的熱點。褐藻糖膠粗品含有一定量的蛋白質(zhì)和色素，不但影響其品質(zhì)，還會影響其生理活性及其他方面的進一步研究[2]。脫蛋白方法主要有酸法[3]、酶法[4]、有機試劑法[5]等，由于酶法成本較高，且酶滅活需要達到100℃，容易破壞多糖結(jié)構(gòu)，不適于大量實驗；堿法效率低，不易回收樣品。因此，本實驗采用酸法和有機試劑法進行實驗，以尋求最佳的實驗參數(shù)。脫色方法主要有物理吸附法，如離子交換樹脂[6]、活性炭[7]，化學(xué)氧化法[8]等。由于樹脂的前后期處理相對復(fù)雜，而活性炭脫色存在殘渣難以除去的問題[9]，因此本實驗采用過氧化氫氧化法脫色。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試 劑 供試試劑為硫酸、苯酚、乙醇（95%）、考馬斯亮藍G-250、葡萄糖、牛血清蛋白、三氯乙酸、正丁醇、氯仿、過氧化氫等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀 器 FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、HY31-01型電熱恒溫水浴鍋（紹興柯橋醫(yī)療器械廠）、UV-1600型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 脫蛋白 Sevag法[10]：氯仿與正丁醇體積比為5∶1，配置成Sevag試劑，褐藻糖膠溶液與Sevag試劑體積比為4∶1，磁力攪拌20min，于分液漏斗中靜置30 min，棄去下層液，并移取一定量上層液測定其蛋白質(zhì)含量和多糖含量，重復(fù)上述操作。

TCA法[11]：配制4mol/L TCA溶液備用。取7支具塞試管，先加入10mL褐藻糖膠溶液，分別取0.1，0.4，0.7，1.0，1.3，1.6，1.9 mL TCA 溶液加入上述試管中，置于冰箱保存過夜，然后將上述混合液離心，測定其蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

Sevag法與TCA法結(jié)合：在上述實驗的基礎(chǔ)上，將Sevag法與TCA法結(jié)合，確定最佳實驗參數(shù)為，Sevag法2次，TCA溶液添加量為1.3 mL/10mL褐藻糖膠溶液。

1.2.2 脫 色 波長的選擇：將待脫色的多糖溶液在250～550 nm處每隔一定波長測定其吸光度，確定最佳吸收波長。

脫色實驗參數(shù)[8]：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定最佳脫色實驗參數(shù)為：過氧化氫添加量為8%，脫色溫度為50℃，脫色時間為7 h。

先脫蛋白后脫色：選用1.2.1的最佳脫蛋白方法先將褐藻糖膠中蛋白質(zhì)除去，再以單因素實驗得到的最佳脫色參數(shù)進行脫色，計算脫色率。

未脫蛋白脫色：將褐藻糖膠溶液直接按照單因素實驗得到的最佳參數(shù)進行脫色，計算脫色率。

1.2.3 測定指標 （1）總糖含量的測定：苯酚-硫酸法[12]。以葡萄糖繪制標準曲線，回歸方程為y=37.829 x-0.013 4，r2=0.995 5。

式中：m1為去除蛋白質(zhì)前原液中多糖的含量；m2為去除蛋白質(zhì)后溶液中多糖的含量。

（2）蛋白質(zhì)含量的測定：考馬斯亮藍G-250法[13]。以牛血清蛋白繪制標準曲線，回歸方程為y=33.628 x+0.018 5，r2=0.997 0。

式中：n1為去除蛋白質(zhì)前原液中蛋白質(zhì)的含量；n2為去除蛋白質(zhì)后溶液中蛋白質(zhì)的含量。

（3）脫色率的計算：以蒸餾水為空白對照，測定溶液色度。

式中：p1為脫色前溶液的吸光度值；p2為脫色后溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫蛋白

2.2.1 Sevag法脫蛋白 圖1、2是采用傳統(tǒng)Sevag法脫蛋白后蛋白質(zhì)和多糖濃度的變化曲線圖。由圖可以看出，當?shù)?次加入Sevag試劑時，蛋白質(zhì)濃度和多糖濃度下降幅度較大，此時的脫蛋白率達到了39.21%，多糖損失率為33.36%。第2次加入Sevag試劑時的蛋白脫除率為50.54%，多糖損失率為39.77%。結(jié)合圖1、2可以得出以下結(jié)論：Sevag法脫蛋白比較劇烈，效果較好，但同時多糖的損失率較大，當?shù)?次加入Sevag試劑，多糖損失了將近一半，損失率為46.18%。因此，Sevag法采用2次為宜，可作為大量粗蛋白的去除劑。

圖1 Sevag法脫蛋白后蛋白質(zhì)濃度的變化

圖2 Sevag法脫蛋白后多糖濃度的變化

2.2.2 TCA法脫蛋白 圖3、4是采用TCA法脫蛋白時蛋白質(zhì)和多糖濃度的變化曲線圖。由圖可以看出，TCA法脫蛋白效果較好，TCA添加量為0.1mL/10mL多糖溶液時，蛋白脫除率已達到45.08%，而此時的多糖損失率僅為4.23%。隨著TCA添加量的增加，蛋白質(zhì)濃度和多糖逐漸降低。當TCA添加量從1.3 mL/10mL多糖溶液增加至1.6 mL/10mL多糖溶液時，多糖損失率從15.15%增加到了29.17%，當TCA添加量為1.9mL/10mL多糖溶液時，多糖損失率更高達67.93%，而此時的蛋白脫除率并未增加多少，因此選擇TCA添加量為1.3mL/10mL多糖溶液。

圖3 TCA法脫蛋白后蛋白質(zhì)濃度的變化

如表1所示，采用Sevag法與TCA法結(jié)合的方法蛋白質(zhì)脫除率最高，達78.68%，而此時的多糖損失率為28.89%，實現(xiàn)了高蛋白脫除率和低多糖損失率的實驗?zāi)康摹?/p>

圖4 TCA法脫蛋白后多糖濃度的變化

表1 Sevag法+TCA法結(jié)合脫蛋白 （%）

2.2 脫色實驗

2.2.1 波長的選擇 由圖5可知，多糖溶液的最長吸收波長在320 nm處，但由于此處讀數(shù)不穩(wěn)定，因此，實驗過程中選擇與最長吸收波長相近但讀數(shù)相對穩(wěn)定的325 nm波長處進行實驗。

圖5 波長掃描圖

2.2.2 脫色效果比較 過氧化氫帶有過氧鍵，容易因過氧鍵斷裂生成過氧自由基，該自由基奪電子能力強，有強氧化性。當過氧化氫與色素作用時，有色物質(zhì)的分子被氧化從而失去原有的顏色，從而起到脫色作用[14]。

多糖中所含的色素一般有兩種，即游離色素和結(jié)合色素[15-16]。由圖6可以看出，脫蛋白后多糖的脫色效果明顯好于多糖原液的脫色效果。這可能由于色素多為結(jié)合色素，與蛋白質(zhì)結(jié)合，在去除蛋白質(zhì)的同時帶走部分色素。多糖原液的脫色率為29.12%，脫蛋白后多糖的脫色率達到了85.17%。

圖6 多糖原液與脫蛋白液脫色效果比較

3 結(jié)論

（1）單獨采用Sevag法脫蛋白，反應(yīng)劇烈，多糖損失率較大，不宜選用。TCA方法較溫和，脫蛋白效果較好，且多糖損失率不大，適合作為多糖的蛋白去除劑。將Sevag法與TCA法結(jié)合脫蛋白效果最佳，Sevag法操作2次，TCA溶液添加量為1.3 mL/10mL多糖溶液，此時蛋白脫除率為78.68%，多糖損失率為28.89%。

（2）脫蛋白后多糖的脫色效果優(yōu)于多糖原液的脫色效果，多糖原液的脫色率為29.12%，脫蛋白后多糖的脫色率達到了85.17%，約為原液脫色率的3倍。除蛋白質(zhì)和色素的褐藻糖膠氫呈淺黃色，溶液澄清，色素明顯減少，對褐藻糖膠進一步分離純化非常有益。

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