擬南芥COI1基因在茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)中的作用

陳 艷，任春梅,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；

2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

茉莉素（jasmonates，JAs）是一類發(fā)現(xiàn)較晚的植物激素，它包括茉莉酸（jasmonic acid，JA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以及由茉莉酸衍生的其他一系列具有相似生物活性的化合物。茉莉素能調(diào)節(jié)許多植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括根生長(zhǎng)、雄蕊發(fā)育、塊莖形成、衰老和果實(shí)成熟等，介導(dǎo)植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗逆反應(yīng)，如：機(jī)械傷害、昆蟲侵害、病原菌侵染和紫外線損傷等。因此，茉莉素對(duì)植物的生存至關(guān)重要。在擬南芥中，如果茉莉素的生物合成或者信號(hào)傳導(dǎo)受阻，植株會(huì)因雄性不育而無(wú)法完成生命周期。同時(shí)，植株也會(huì)因失去對(duì)逆境(如昆蟲侵害、病原菌侵染等)的抗性而無(wú)法生存。在茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)中，COI1基因起著非常重要的作用。缺失該基因的擬南芥植株喪失了所有的茉莉素反應(yīng)，表現(xiàn)為雄性不育、易感染病蟲害等。

1 COI1基因突變對(duì)茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)的影響

1994年Feys[1]等篩選獲得了對(duì)植物毒素冠菌素（COR，COR）不敏感的擬南芥突變體coi1（COR-insensitive1）。冠菌素是假單胞菌分泌的一種致病毒素，與茉莉素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性。他們發(fā)現(xiàn)篩選出的所有coi1突變體都對(duì)茉莉酸甲酯不敏感，并且表現(xiàn)為雄性不育。隨后的研究發(fā)現(xiàn)coi1突變體易感病蟲害，而且失去了對(duì)茉莉素的正常反應(yīng)，如茉莉素誘導(dǎo)的基因表達(dá)，茉莉素誘導(dǎo)的花青素積累和側(cè)根形成等。

1998年Xie等[2]采用圖位克隆法分離出擬南芥COI1基因。該基因編碼一個(gè)含有592個(gè)氨基酸的F-box蛋白。在coi1-1突變體中，編碼COI1蛋白第467個(gè)氨基酸色氨酸的密碼子突變成了終止密碼子，從而形成沒(méi)有功能的COI1蛋白片斷。因此，coi1-1突變體完全失去茉莉素介導(dǎo)的生物功能，表現(xiàn)為完全雄性不育、易感病蟲害、不表達(dá)茉莉素誘導(dǎo)基因等。而在COI1弱突變體coi1-2中，COI1蛋白的第245個(gè)氨基酸由亮氨酸變成了苯丙氨酸，表現(xiàn)為部分地喪失了COI1的功能。與野生型植株相比，coi1-2突變體雖然對(duì)茉莉素的反應(yīng)以及對(duì)病蟲害等逆境的敏感性都極顯著地降低，但對(duì)茉莉素仍有輕微的反應(yīng)，表現(xiàn)為部分不育、能產(chǎn)生少量的種子等。由此可見，COI1功能完全喪失會(huì)完全中斷茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)，而COI1部分功能喪失也會(huì)影響茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)。因此，在茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，COI1起著至關(guān)重要的作用，是必不可少的控制因子。

2 SCFCOI1復(fù)合體介導(dǎo)茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)

1998年Xie等[2]通過(guò)對(duì)分離的COI1基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)COI1是一種F-box蛋白。在酵母和哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)-box蛋白能與Skp1和Cullin蛋白結(jié)合組裝成SCF泛素蛋白連接酶復(fù)合體（Skp1-Cullin-F-box protein complex）。該復(fù)合體可以識(shí)別并泛素化某些底物蛋白，進(jìn)而使這些底物蛋白通過(guò)26S蛋白酶體降解。因此，COI1的克隆首次暗示著泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑參與茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)。隨后的研究證明了COI1作為F-box蛋白，能與擬南芥Cullin1蛋白和類似于Skp1的擬南芥ASK1或ASK2組裝成SCFCOI1復(fù)合體，介導(dǎo)茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)[3－5]。COI1完全突變體coi1-1喪失了茉莉素調(diào)控的所有反應(yīng)，正是由于突變的COI1蛋白不能形成SCFCOI1復(fù)合體所導(dǎo)致。位于COI1蛋白F-box結(jié)構(gòu)域的第22位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)楸彼幔矔?huì)破壞SCFCOI1復(fù)合體的形成，從而喪失了對(duì)茉莉素的反應(yīng)[3]。與擬南芥COI1同源的大豆F-box蛋白GmCOI1也能與擬南芥的ASK1和Cullin1形成SCFCOI1復(fù)合體，介導(dǎo)茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)[6]，說(shuō)明F-box蛋白COI1是植物茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)中保守的成分。

3 JAZ蛋白是SCFCOI1復(fù)合體的一類底物蛋白

2007年，Thines和Chini等[7-8]分別發(fā)現(xiàn)含有12個(gè)成員的JAZ蛋白家族是茉莉素信號(hào)途徑中的一類抑制蛋白。JAZ蛋白是SCFCOI1泛素連接酶復(fù)合體的一類直接底物。茉莉素信號(hào)分子可以誘導(dǎo)SCFCOI1復(fù)合體結(jié)合JAZ蛋白，使其泛素化并通過(guò)26S蛋白酶體降解，最終解除JAZ蛋白對(duì)茉莉素信號(hào)通路的抑制作用，引起下游茉莉素反應(yīng)。

JAZ蛋白含有中央的27個(gè)氨基酸組成的ZIM結(jié)構(gòu)域和C末端Jas結(jié)構(gòu)域。ZIM結(jié)構(gòu)域同時(shí)也介導(dǎo)JAZ蛋白與其共抑制因子NINJA的相互作用，從而共同抑制茉莉素信號(hào)通路[9]。Jas結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)JAZ蛋白對(duì)茉莉素信號(hào)通路正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYC2的直接抑制作用[7,10]。

JAZ家族成員眾多，且有不同的轉(zhuǎn)錄本。例如JAZ10.4是JAZ10基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。JAZ10.4在活性茉莉素分子存在的情況下不能與COI1相互作用，但仍可抑制轉(zhuǎn)錄因子MYC2。JAZ10.4可以通過(guò)ZIM結(jié)構(gòu)域與自己或其他JAZ蛋白形成同源或異源二聚體的形式拮抗茉莉素反應(yīng)[11]。這種特殊轉(zhuǎn)錄本的存在很可能會(huì)抑制過(guò)度的茉莉素反應(yīng)。其他JAZ家族成員也普遍存在相似的機(jī)制[12]，這使得茉莉素信號(hào)途徑更為豐富。

4 COI1是茉莉素信號(hào)傳導(dǎo)的受體

在JAZ蛋白被報(bào)道之后，很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示SCFCOI1-JAZ復(fù)合體是接收茉莉素信號(hào)并啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的感受復(fù)合體[13-14]。但至此還不清楚SCFCOI1-JAZ復(fù)合體中哪一個(gè)蛋白是茉莉素的受體。2009年4月，Roberto Solano實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)螯合異亮氨酸（Ile）的茉莉酸分子（+）-7-iso-JA-Ile是植物體內(nèi)茉莉素的活性形式[15]，這為茉莉素受體的發(fā)現(xiàn)提供有利條件。

2009年，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院謝道昕教授實(shí)驗(yàn)室通過(guò)遺傳學(xué)和分子生化的方法，證明了COI1是茉莉素的受體[16]。首先，通過(guò)與生長(zhǎng)素受體TIR1的同源分析，建立了一個(gè)COI1的分子模型，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，得到一個(gè)高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)模型，從而分析其作為受體的可行性。該實(shí)驗(yàn)室結(jié)合COI1的高質(zhì)量分子結(jié)構(gòu)模型，進(jìn)一步通過(guò)一系列的生化和遺傳實(shí)驗(yàn)證明了COI1與JA-Ile以及冠菌素的直接作用，最后得到了一個(gè)COI1為受體的茉莉素信號(hào)感應(yīng)模型，即：JA-Ile與COI1結(jié)合模型。

5 COI1-JAZ共受體模型

2010年10月，Sheard等[17]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉素的感受機(jī)制是受肌醇磷酸增強(qiáng)的COI1-JAZ共受體形式。COI1的晶體結(jié)構(gòu)：總體構(gòu)架類似于TIR1，有一個(gè)N端的三螺旋 F-box模體（接近ASK1），C端由18個(gè)串聯(lián)的LRRs形成了馬蹄形腔結(jié)構(gòu)域。與TIR1類似，COI1 LRR結(jié)構(gòu)域的上表面有三個(gè)內(nèi)部重復(fù)的長(zhǎng)環(huán)——loop-2,loop-12 and loop-14，這在激素與多肽底物的結(jié)合中起作用。與TIR1不同的是，在COI1 LRR結(jié)構(gòu)域折疊的C端頂部序列存在第四個(gè)長(zhǎng)環(huán)loop-c，它在loop-2的上方，部分地覆蓋loop-2。盡管擁有相似的骨架結(jié)構(gòu)，COI1形成了一個(gè)與TIR1完全不同的激素結(jié)合區(qū)域。以loop-2和LRR腔內(nèi)表面之間結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，COI1的配體結(jié)合口袋特有地被氨基酸側(cè)鏈環(huán)繞。形成這一口袋的許多殘基為大氨基酸且?guī)в袠O性的頭部。這一特性使得他們?cè)诮Y(jié)合配體的某一化學(xué)組分時(shí)，可以使結(jié)合口袋形成一個(gè)特定的結(jié)構(gòu)。這一近作用在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，對(duì)正確的激素感知復(fù)合體是極其重要的，COI1蛋白這些側(cè)鏈上的大氨基酸某一位點(diǎn)的突變足以打斷COR存在條件下COI1-JAZ1的結(jié)合。在結(jié)合口袋，JA-Ile和COR均處于“向上”的位置，它們共有的環(huán)戊酮的酮基向上，與COI1口袋入口的Arg 496和Tyr 444形成了三角的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。在沒(méi)有JAZ降解子肽鏈的結(jié)合，這一酮基部分是可以被溶解的。JA-Ile和COR環(huán)戊酮環(huán)的剩余部分夾在COI1上的芳香族成員Phe 89和Tyr 444之間，以疏水作用穩(wěn)定。

COR上的環(huán)己烯環(huán)提供了一個(gè)平整的表面緊密地和Phe89聯(lián)系，同時(shí)JA-Ile更具彈性和伸展的苯環(huán)側(cè)鏈與loop2上的Ala 86,Phe 89和Leu 91和LRRs上的 Leu 469和Trp 519結(jié)合，這一聯(lián)系更為松弛。這一不同或許可以解釋結(jié)合實(shí)驗(yàn)中COR比（3R,7S）-JA-Ile幾乎高出十倍。

激素結(jié)合口袋的深處，JA-Ile和COR的酰胺和羧基組分通過(guò)與COI1的三個(gè)氨基酸殘基Arg 85,Arg 348和Arg 409，形成一個(gè)鹽橋和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合在結(jié)合位點(diǎn)的底部。同時(shí)，那些精氨酸殘基構(gòu)成了激素口袋的帶電平臺(tái)。Tyr 386則通過(guò)與激素的氨基組分形成氫鍵從頂部加強(qiáng)作用。這樣，Tyr386到達(dá)了配體的環(huán)戊酮環(huán)，縮小了口袋入口并使下方形成了一個(gè)疏水的腔?；康氖Ｓ嗖糠謩t由Val 411,Ala 384和Arg 409的脂肪側(cè)鏈形成。而COR和JA-Ile的亮氨酸側(cè)鏈得的乙基環(huán)丙烷組分的大小和疏水性使其二者很少地適合這一空間。這一腔的性質(zhì)可以解釋COI1對(duì)JA衍生物的選擇性，即必須包含一個(gè)中度大小的疏水氨基酸。雖然這一配體的大部分結(jié)構(gòu)包裹在結(jié)合區(qū)域內(nèi)部，頂部的酮基和底部的羧基部分仍然暴露在外，這使得其可與共受體中的JAZ部分作用。

COI1的開放口袋高特異地識(shí)別活性激素形式（3R，7S）-JA-Ile，高親和的激素結(jié)合需要一個(gè)雙向的JAZ降解序列，在之前的研究中，JAZ蛋白與COI1蛋白的結(jié)合區(qū)域是位于C端的Jas模體，包含SLX2FX2KRX2RX5PY共同序列并在之前有兩個(gè)連續(xù)的基本殘基。為進(jìn)一步定位Jas模體中與COI1高親和配體結(jié)合這一微小區(qū)域，運(yùn)用合成的JAZ1多肽片段進(jìn)行配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，最終將由Glu 200-Val 220這一段短序列定義為JAZ1降解子（JAZ1 degron）。這一序列包括一個(gè)保守的α-螺旋以錨定在COI1上，還有一個(gè)環(huán)狀區(qū)域以攔截激素使進(jìn)入COI1的結(jié)合口袋。

此外，肌醇-5-磷酸作為第三種重要組分被發(fā)現(xiàn)，它與COI1和JAZ均互作，并接近激素所處位置。這一發(fā)現(xiàn)，高度體現(xiàn)了COI1蛋白作為F-box蛋白，起多分子信號(hào)中心的作用。

6 小 結(jié)

茉莉素受體COI1的分離和證明使人們對(duì)茉莉素感知及下游信號(hào)通路起始的分子機(jī)制有了更直接、深刻的認(rèn)識(shí)。而同時(shí)，COI1與JAZ蛋白作為共受體形式共同感受茉莉素，這對(duì)于F-box蛋白的研究有了進(jìn)一步的功能認(rèn)識(shí)，豐富了植物激素與受體之間作用模式及激素信號(hào)傳導(dǎo)的方式，具有重要意義。

[1] Feys B,Benedetti C E,Penfold C N,et al.Arabidopsis Mutants Selected for Resistance to the Phytotoxin CORAre Male Sterile,Insensitive to Methyl Jasmonate,and Resistant to a Bacterial Pathogen[J].Plant Cell,1994,（5）:751-759.

[2]Xie D X,Feys B F,James S,et al.COI1:an Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility[J].Science,1998,280:1091-1094.

[3]Xu LH,Liu FQ,Lechner E,et al.The SCFCOl1 ubiquitin-ligase complexes are required for jasmonate response in Arabidopsis[J].Plant Cell,2002,14:1919-1935.

[4]Liu F,NiW,Griffith M E,et al.The ASK1 and ASK2 genes are essential for Arabidopsis early development[J].Plant Cell,2004,16:5-20.

[5] Ren C,Pan J,Peng W,et al.Point mutations in Arabidopsis Cullin1 reveal its essential role in jasmonate response[J].Plant J,2005,42:514-524.

[6] Wang Z,Dai L,Jiang Z,et al.GmCOI1,a soybean F-box protein gene,shows ability tomediate jasmonate-regulated plant defense and fertility in Arabidopsis[J].Mol Plant Microbe Interact.,2005,（12）:1285-1295.

[7] Thines B,Katsir L,Melltto M,et al.JAZ repressor proteins are targets of the SCF（COI1）complex during jasmonate signalling[J].Nature,2007,448（7154）:661-665.

[8] Chini A,Fonseca S,Fernandez G，et al.The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling[J].Nature,2007，448（7154）:666-671.

[9] Pauwels L,Barbero G F,Geerinck J,et al.NINJA connects the co-repressor TOPLESS to jasmonate signalling[J].Nature,2010,464（7289）:788-791.

[10]Melotto M,Mecey C,Niu Y,et al.A critical role of two positively charged amino acids in the Jasmotif of Arabidopsis JAZ proteins in mediating COR-and jasmonoyl isoleucine-dependent interactionswith the COI1 F-box protein[J].Plant J,2008,55:979-988.

[11]Chung H S,Howe G A.A critical role for the TIFY motif in repression of jasmonate signaling by a stabilized splice variant of the JASMONATE ZIM-domain protein JAZ10 in Arabidopsis[J].Plant Cell,2009,（1）:131-145.

[12]Chung H S,Cooke T F,Patel L C，et al.Alternative splicing expands the repertoire of dominant JAZ repressors of jasmonate signaling[J].Plant J,2010,（5）:29.

[13]Katsir L,Schilmiller A L,Staswick P E,et al.COI1 is a critical component of a receptor for jasmonate and the bacterial virulence factor COR[J].Proc Natl Acad Sci USA.,2008,105（19）:7100-7105.

[14]Chini A,Fonseca S,Fernandez G，et al.The ZIM domain mediates homo-and heteromeric interactions between Arabidopsis JAZ proteins[J].Plant J,2009,59（1）:77-87.

[15]Fonseca S,Chini A,Hamberg M,et al.（+）-7-iso-Jasmonoyl-L-isoleucine is the endogenous bioactive jasmonate[J].Nat Chem Biol,2009,（5）:344-350.

[16]Yan J,Zhang C,Gu M,et al.The Arabidopsis CORINSENSITIVE1 protein is a jasmonate receptor[J].Plant Cell,2009,（8）:2220-2236.

[17]Sheard L B,Tan X,Mao H,et al.Jasmonate perception by inositol-phosphate-potentiated COI1–JAZ co-receptor[J].Nature,2010,468（7322）:400-405.