烏桕葉提取物的體外抑菌試驗

彭小列，劉世彪，張 麗，楊 珂

（吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

烏桕[Sapium sebiferum（L.）Roxb]又名烏果樹、烏桕籽、木梓、桕子柴等，系大戟科烏桕屬落葉喬木，在我國南方分布較廣。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，烏桕性涼、味苦、具小毒，其葉、根、皮入藥能清熱解毒、消腫、利水通便、療毒等，主治頭痛、牙疼、水腫、濕瘡、疥癬、蛇傷和肝硬化等病癥[1]。湘西民間有利用烏桕葉來治療人和畜禽的腹瀉及細(xì)菌性感染疾病的習(xí)俗。目前，治療家禽、家畜疾病采用的藥物及其飼料添加物質(zhì)多為抗生素、化學(xué)合成藥物和激素等，這些物質(zhì)在治療和飼料中長期使用，會產(chǎn)生一定的副作用和殘留，最終危害人體健康。天然的中草藥具有營養(yǎng)性和藥物性的雙重作用，既能促進(jìn)機(jī)體代謝又能增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，中草藥的抑菌功能可以用作藥物或飼料添加劑來治病防病[2-3]。關(guān)于烏桕根皮水提物的抑菌試驗已有報道[4]，而有關(guān)烏桕葉抑菌試驗的受試菌較少，了解尚不深入[5-6]。本文用烏桕葉的水提物和醇提取物對大腸桿菌等8種受試病原菌進(jìn)行了抑菌測定，并用二倍稀釋法測定了其最小抑菌濃度，以期為烏桕葉在畜禽疾病治療方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 烏桕葉采自湖南省湘西自治州永順縣城郊外。原植物經(jīng)吉首大學(xué)植物分類學(xué)張代貴教授鑒定為大戟科植物烏桕 [Sapium sebiferum（L.） Roxb]。

1.1.2 指示菌 雞白痢沙門氏桿菌（Salmonella pullorum）、豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）由中國獸藥監(jiān)察所提供；大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、白念球菌（Candida albicans）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由吉首大學(xué)微生物教研室提供。

1.1.3 試驗儀器和試劑 恒溫干燥箱、RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器、FDU-1200冷凍干燥機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋。乙醇（分析純，上海國藥集團(tuán)）、乳酸恩諾沙星（菌必殺）SP（杭州富陽市動物保健藥品廠）。

1.2 方法

1.2.1 烏桕葉提取液的制備 （1）水提取液的制備。取烏桕葉粉末40 g，加入6倍蒸餾水（m/v），封口膜封口，超聲波處理30 min，在恒溫干燥箱（60℃）中放置24 h，趁熱減壓抽濾，濾渣再加入3倍蒸餾水，在恒溫干燥箱放置12 h，再次抽濾，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于50℃條件下濃縮至干，用滅菌水溫溶并定容至100mL而成水懸濁液，獲得0.4 g/mL的生藥水提取物，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?）乙醇提取液的制備。取烏桕葉粉末40 g，加入3倍（m/v）的95%乙醇，封口膜封口，超聲波處理30min，振蕩浸泡提取24 h，減壓抽濾，濾渣再加入3倍的95%乙醇，浸泡提取12 h,減壓抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮（50℃）至粘稠狀，用冷凍干燥機(jī)蒸發(fā)成干粉狀（24 h），用甲醇溶解并定容至100mL，配成0.4 g/mL的生藥醇提取物，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸恩諾沙星液的制備 取乳酸恩諾沙星（菌必殺）0.05~0.1 g加蒸餾水定容至1 000mL，配成0.005%～0.01%的溶液，作為陽性對照。

1.2.3 培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制方法為，先稱取牛肉膏1.5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g,瓊脂8 g,再加入蒸餾水500mL，用蒸汽壓力滅菌鍋在121℃下滅菌30min，冷卻至45℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抑菌試驗 （1）供試菌株的活化和菌懸液的制備。將所有供試菌株接入斜面培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，置4℃冰箱中備用。用接種環(huán)挑取試驗菌種，放入裝有玻璃球的50 mL無菌生理鹽水中，于振蕩培養(yǎng)箱中，37℃振蕩培養(yǎng)18~24 h，使菌分布均勻，采用比濁法以無菌水將菌液稀釋成濃度為106~107cfu/mL的各種試驗菌懸液，于4℃下保存?zhèn)溆谩＃?）杯碟法抑菌試驗。于超凈工作臺內(nèi)，向無菌培養(yǎng)皿中倒入滅過菌的含2%瓊脂的水瓊脂10mL作為下層，凝固后再倒入10mL培養(yǎng)基（瓊脂為1%）和0.5 mL含指示菌的菌懸液混合液作為上層。凝固后，將4個已滅菌的牛津杯（外徑為8 mm）等距離地裝在帶菌平板上，依次在各杯中加入菌必殺、烏桕葉水提液和烏桕葉醇提取液各0.2mL，以無菌水作為對照，標(biāo)記各培養(yǎng)皿和杯位號后，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑（以抑菌圈直徑大于6 mm者評價為有抑菌作用，無菌水對照組應(yīng)無抑制圈產(chǎn)生）。各提取液的每項抑菌試驗平行重復(fù)3次，取其平均值作為測定結(jié)果。（3）最低抑菌濃度（MIC）的測定。抑菌濃度測定采用2倍稀釋法。在無菌條件下，取滅菌試管6只，以烏桕葉水提取液（0.4 g/mL）作為100%原液，取10mL放入第1管，再從第1管中取出5mL烏桕葉水提液加入第2管，另取5 mL滅菌水加入混勻；再從第2管中取出5mL溶液加入第3管，同時加入滅菌水5 mL，混勻。依此作倍比稀釋，使各管生藥提取液的濃度分別為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 和 0.012 5 g/mL，另取一支試管加入10mL滅菌水作對照。同法配制烏桕葉的醇提液，以甲醇進(jìn)行稀釋，另取一支試管加入10 mL甲醇作對照。向上述12支試管分別加入24片直徑6 mm的圓濾紙片，混合均勻，浸漬1 d后風(fēng)干。在無菌條件下，吸取0.1mL適宜濃度的各類菌懸液加入到備用平板培養(yǎng)基上，涂布均勻。將上述處理過的濾紙片貼到培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿等距離貼4片濾紙片，分別為烏桕水提液、烏桕醇提液、滅菌水和甲醇。37℃下培養(yǎng)24 h，用十字交叉法測定抑菌圈直徑大小，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏桕葉的抑菌作用

測得烏桕葉的水提取液和乙醇提取液對大腸桿菌等指示菌的抑制作用，見表1。

表1 烏桕葉的水提取液和乙醇提取液的抑菌作用

表1顯示，烏桕葉提取物對各種供試致病細(xì)菌均有一定的抑制作用。其中水提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、白念球菌和雞白痢沙門氏桿菌的抑菌效果為中度靈敏，對枯草桿菌抑菌效果為低度靈敏，對豬丹毒絲菌和多殺性巴氏桿菌抑制效果為不靈敏。醇提取液對變形桿菌和雞白痢沙門氏桿菌的抑制效果為高度靈敏，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌和白念球菌的抑制效果為中度靈敏，對豬丹毒絲菌和多殺性巴氏桿菌抑制效果為低度靈敏。烏桕醇提取物比水提取物的抑菌效果要好，表明其葉中的有效成分多為醇溶性的。特異的陽性對照菌必殺除對豬丹毒絲菌的抑菌作用為中度靈敏外，對其余病原菌的抑菌作用均為高度靈敏，而對照無菌水無抑菌作用。與菌必殺相比，烏桕葉提取物對上述細(xì)菌的抑菌效果適中，但它對雞白痢沙門氏桿菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用仍很明顯。

2.2 烏桕葉的最低抑菌濃度

用二倍稀釋法測定的烏桕水提液對供試菌的最低抑菌濃度（MIC），見表2。

表2 烏桕水提液對供試菌的最低抑菌濃度（MIC）（g/mL）

由表2可知，烏桕葉水提液對豬丹毒絲菌和多殺性巴氏桿菌的最小抑菌濃度為0.4 g/mL，對大腸桿菌、枯草桿菌、白念球菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.2 g/mL，對變形桿菌和雞白痢沙門氏桿菌的最小抑菌濃度為0.1 g/mL。

用二倍稀釋法測定的烏桕葉醇提液對供試菌的最低抑菌濃度（MIC），見表3。

表3 烏桕醇提液對各供試菌的最低抑菌濃度（MIC）（g/mL）

表3表明，烏桕葉醇提液對豬丹毒絲菌和多殺性巴氏桿菌的最小抑菌濃度為0.2 g/mL，對大腸桿菌、枯草桿菌、白念球菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.1 g/mL，對變形桿菌和雞白痢沙門氏桿菌的最小抑菌濃度為0.05 g/mL。與烏桕葉水提液對各類病原菌的最小抑菌濃度相比，醇提液的濃度相應(yīng)地降低1/2，說明醇提液中含有更多的抑菌活性物質(zhì)。

3 討論

烏桕根皮作為傳統(tǒng)的中草藥，毒副作用小，在民間用于治療由大腸桿菌引起的腹瀉和志賀氏桿菌引起的痢疾，療效很好，原因在于其水提物對大腸桿菌和志賀氏桿菌具有抑制作用[4]，而對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌沒有活性。但有試驗表明，烏桕葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最大，尤其是其乙醇提取物的乙酸乙酯可溶部的抑菌活性最強(qiáng)。本試驗表明，烏桕葉的水提液和醇提液對大腸桿菌等8種受試菌均具有不同程度的抑菌活性，尤其對雞白痢沙門氏桿菌和變形桿菌的抑菌作用明顯。抑菌試驗和最小抑菌濃度試驗都表明，烏桕葉醇提液的抑菌效力更強(qiáng)，表明抑菌的主要有效成分是醇溶性的。霍光華等在烏桕葉抑菌活性功能成分的研究中指出，其抑菌活性的先導(dǎo)物應(yīng)是具有相當(dāng)極性的一些化合物，即以酸類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)為主，由不同結(jié)構(gòu)物質(zhì)的協(xié)同作用而產(chǎn)生活性。烏桕葉提取物的抑菌效果明顯，可以直接用于治療因病菌引起的人畜疾病，或作為食品添加劑和飼料添加劑加以開發(fā)利用。

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