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    環(huán)孢素對大鼠牙齦上皮細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

    2011-03-07 09:40:36劉培紅馬肅陳力
    華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:環(huán)孢素陽性細(xì)胞陽性

    劉培紅 馬肅 陳力

    (1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 牙周科;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 科研科,哈爾濱 150001)

    環(huán)孢素對大鼠牙齦上皮細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

    劉培紅1馬肅1陳力2

    (1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 牙周科;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 科研科,哈爾濱 150001)

    目的 觀察環(huán)孢素(CsP)對大鼠牙齦上皮細(xì)胞凋亡活動、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響,探討CsP致牙齦上皮增厚的可能機(jī)制。方法 SPF級7周齡雄性Wistar大鼠80只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,每組又分為10、20、30、40 d亞組,實(shí)驗(yàn)組胃飼含CsP鮮牛奶,對照組胃飼等量鮮牛奶。經(jīng)心灌注4%多聚甲醛,固定取材,制作下頜第一磨牙頰舌向石蠟切片,原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測牙齦上皮細(xì)胞原位凋亡,免疫組化PV兩步法檢測Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)。利用圖像分析系統(tǒng)計算牙齦上皮細(xì)胞凋亡率和Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率,并測量Bcl-2蛋白平均灰度,行完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計方差分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)細(xì)胞凋亡率和Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率下調(diào),與對照組有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)Bcl-2蛋白平均灰度上調(diào),與對照組有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 環(huán)孢素導(dǎo)致牙齦上皮增厚可能與干擾線粒體凋亡途徑、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

    環(huán)孢素; 藥物性牙齦增生; 細(xì)胞凋亡

    免疫抑制劑環(huán)孢素(Ciclosporin,CsP)可誘導(dǎo)藥物性牙齦增生,影響牙周組織健康和美觀,但CsP誘導(dǎo)牙齦增生的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,尤其是CsP對牙齦上皮組織的影響,結(jié)論存在分歧[1]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,定量分析CsP對大鼠牙齦上皮細(xì)胞凋亡活動、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響,旨在探討CsP致大鼠牙齦上皮增厚可能的發(fā)病機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 藥物、試劑和儀器

    CsP(商品名:新山地明,瑞士諾華制藥有限公司)。兔抗鼠Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體(武漢博士德有限公司);原位缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUT nick endlabeling,TUNEL)法檢測試劑盒(美國羅氏公司);PV兩步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。Leica DM2500光學(xué)顯微鏡(德國萊卡公司),Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司)。

    1.2 動物選擇、分組和建模

    選取由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供的SPF級7周齡雄性Wistar大鼠80只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,每組又分為10、20、30、40 d亞組,隔離器飼養(yǎng),正常食水。實(shí)驗(yàn)組胃飼質(zhì)量濃度為5mg·mL-1的CsP鮮牛奶混濁液,CsP攝入量為每天30mg·kg-1,對照組胃飼不含CsP的等量鮮牛奶。

    1.3 取材、TUNEL法及免疫組織化學(xué)染色

    按實(shí)驗(yàn)設(shè)計取材、固定、脫鈣后,以下頜第一磨牙近中面為包埋面常規(guī)方法制作下頜磨牙區(qū)牙周牙體聯(lián)合組織蠟塊,4μm厚頰舌向連續(xù)切片。選擇下頜第一磨牙近遠(yuǎn)中面中點(diǎn)處組織切片5張,1張行TUNEL法檢測牙齦上皮凋亡細(xì)胞,2張行Bcl-2和2張行Caspase-3蛋白的PV兩步法免疫組織化學(xué)染色,操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.4 結(jié)果判定

    TUNEL陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒,定位于胞核內(nèi);Caspase-3蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒,定位于胞核內(nèi)和胞漿內(nèi);Bcl-2蛋白陽性表達(dá)呈棕褐色顆粒,定位于胞漿內(nèi)和胞核表面。每張TUNEL和Caspase-3蛋白陽性切片在光鏡下(×400倍)隨機(jī)選取上皮內(nèi)5個陽性表達(dá)最多的視野,每個高倍視野計數(shù)100個細(xì)胞,取平均值記錄凋亡指數(shù)(apoptotic index,API)和Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率。每張Bcl-2蛋白陽性切片在光鏡下(×630倍)隨機(jī)選取上皮內(nèi)5個陽性表達(dá)最多的視野,測定Bcl-2蛋白的平均灰度,取其平均值。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件包對各組數(shù)值進(jìn)行完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計資料的方差分析,P< 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TUNEL檢測結(jié)果

    TUNEL陽性細(xì)胞定位于口腔齦上皮、溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮。實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)API在頰側(cè)和舌側(cè)均顯著小于對照組,各實(shí)驗(yàn)組間API在頰側(cè)和舌側(cè)均無明顯差異(表1)。

    表1 頰側(cè)和舌側(cè)數(shù)據(jù)析因統(tǒng)計分析結(jié)果P值Tab 1 P value of bucco-lingual data by analysis of variance of factorial design

    2.2 Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果

    Caspase-3陽性表達(dá)定位于口腔齦上皮、溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮,主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞層的細(xì)胞核內(nèi),少量表達(dá)于細(xì)胞漿中(圖1、2)。實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率在頰側(cè)和舌側(cè)均顯著小于對照組,各實(shí)驗(yàn)組間Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)率在頰側(cè)和舌側(cè)均無明顯差異(表1)。

    圖1 對照組大鼠牙齦上皮內(nèi)Caspase-3蛋白的表達(dá) PV ×400Fig 1 Expression of Caspase-3 in gingival epithelium of the control group PV ×400

    2.3 Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果

    Bcl-2蛋白陽性表達(dá)定位于口腔齦上皮棘細(xì)胞層胞漿內(nèi)和胞核表面,主要集中于附著齦近膜齦聯(lián)合處,頰側(cè)多于舌側(cè),上皮釘突處密集表達(dá)(圖3、4)。實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)Bcl-2蛋白的平均灰度在頰側(cè)顯著大于對照組,在舌側(cè)無明顯差異,各實(shí)驗(yàn)組間Bcl-2蛋白的平均灰度在頰側(cè)和舌側(cè)均無明顯差異(表1)。

    圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)Caspase-3蛋白的表達(dá) PV ×400Fig 2 Expression of Caspase-3 in gingival epithelium of the experimental group PV ×400

    圖3 對照組大鼠牙齦上皮內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá) PV ×630Fig 3 Expression of Bcl-2 in gingival epithelium of the control group PV ×630

    3 討論

    免疫抑制劑、鈣通道阻滯劑和抗癲癇藥物可導(dǎo)致藥物性牙齦增生,其中免疫抑制劑CsP導(dǎo)致牙齦增生的發(fā)病率高達(dá)30%~50%[1],嚴(yán)重影響牙周組織健康和美觀。但是藥物性牙齦增生的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,近年來,關(guān)于CsP導(dǎo)致牙齦上皮增厚的現(xiàn)象逐漸成為關(guān)注熱點(diǎn)[2]。

    組織增生包括細(xì)胞增殖增加和/或細(xì)胞凋亡減少,牙齦上皮增厚的發(fā)病機(jī)理也應(yīng)如此。Shimizu等[3]以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,研究認(rèn)為硝苯地平誘導(dǎo)的牙齦上皮增生不是角化細(xì)胞增殖增加,而是通過細(xì)胞凋亡減少而使細(xì)胞周期延長所致,他們特別指出細(xì)胞周期延長在肉眼可見的增生發(fā)生前就已經(jīng)發(fā)生了。相似的,Niimi等[4]指出服用環(huán)孢霉素A的腎移植患者牙齦增生不是由于角化細(xì)胞增殖,而是由于細(xì)胞壽命延長。近來,Buduneli等[5]測定環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)的牙齦增生細(xì)胞的分裂率和凋亡率,指出凋亡減少可能比細(xì)胞分裂增加在環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)的牙齦增生的發(fā)病機(jī)制中起著更突出的作用。他們的結(jié)果暗示牙齦上皮增生不是由于角化細(xì)胞增殖率增加,而是由于角化細(xì)胞的壽命增加或是經(jīng)歷凋亡細(xì)胞的能力改變。本課題組假設(shè)這也是引起CsP導(dǎo)致牙齦上皮增厚的生物學(xué)基礎(chǔ),故將本實(shí)驗(yàn)聚焦于CsP對大鼠牙齦上皮細(xì)胞凋亡通路影響的研究。

    細(xì)胞凋亡是Kerr等于1972年首次提出的一個形態(tài)學(xué)概念,是指與細(xì)胞壞死不同的受基因控制的有序的細(xì)胞死亡形式[6],其啟動受控于多種因素[7-9]。Bcl-2是膜的整合蛋白,存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及核膜上,但主要定位于線粒體膜,其生物學(xué)功能為抑制線粒體內(nèi)促凋亡因子的釋放,在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用,為重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白,常被作為細(xì)胞凋亡早期和中期的檢測指標(biāo)[7]。Caspase-3是細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶,是引起細(xì)胞凋亡的最終關(guān)鍵執(zhí)行酶,一旦被細(xì)胞凋亡的信號途徑激活,能直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段,常被作為細(xì)胞凋亡中期和晚期的檢測指標(biāo)[8]。TUNEL法是運(yùn)用分子生物學(xué)原理結(jié)合形態(tài)學(xué)特征檢測細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂后形成的原位凋亡細(xì)胞技術(shù),是細(xì)胞凋亡晚期的經(jīng)典檢測方法[9]。

    本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:與對照組相比較,實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)Bcl-2和Caspase-3蛋白陽性表達(dá)范圍和表達(dá)密度發(fā)生明顯變化,這種變化具有部位特異性,在頰側(cè)附著齦近膜齦聯(lián)合處Bcl-2蛋白陽性表達(dá)明顯增加,Caspase-3蛋白陽性表達(dá)明顯減少。實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮釘突少或無的部位,棘細(xì)胞層厚度一般無變化,而顆粒細(xì)胞層略增厚,此處Bcl-2蛋白陽性表達(dá)少或無,Caspase-3蛋白陽性表達(dá)分布不均勻,但比對照組略減少。而在牙齦上皮釘突伸長增寬部位,除顆粒細(xì)胞層增厚以外,往往伴有棘細(xì)胞層明顯增厚現(xiàn)象,這與Wondimu等[10]和Bulut等[11]研究發(fā)現(xiàn)相似。此處Bcl-2蛋白陽性表達(dá)明顯增多,上方顆粒細(xì)胞層中Caspase-3陽性表達(dá)明顯減少。

    本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計學(xué)結(jié)果同樣表明:與對照組相比較,實(shí)驗(yàn)組大鼠牙齦上皮內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)上調(diào),Caspase-3蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡指數(shù)下調(diào),各組數(shù)值在實(shí)驗(yàn)組和對照組間均有顯著差異,且頰側(cè)較舌側(cè)差異更為明顯,這與本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[12]。推測:CsP可以通過抑制牙齦上皮細(xì)胞凋亡活動而導(dǎo)致大鼠牙齦上皮增厚,并且抑制凋亡的機(jī)制可能存在部位差異。CsP可能通過抑制牙齦上皮釘突處Bcl-2蛋白的表達(dá)而抑制線粒體凋亡途徑,從而使該處牙齦上皮增厚,而牙齦上皮其他部位增厚可能由于啟動其他信號而導(dǎo)致Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)生變化而抑制凋亡。但是CsP對大鼠牙齦上皮部位差異性影響的真正機(jī)制尚需深入研究。

    [1] 孟煥新.牙周病學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:145. MENG Huan-xin.Periodontology[M].3rd ed.Beijing:People’s Medical Publishing House,2008:145.

    [2] 劉培紅,馬肅.環(huán)孢素誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞增生的機(jī)制[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,36(1):81-83.

    LIU Pei-hong,MA Su.Pathogenesis of Ciclosporin-induced gingival epithelial hyperplasia[J].Int J Stomatol,2009,36(1):81-83.

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    [5] Buduneli N,Buduneli E,Cinar S,et al.Immunohistochemical evaluation of ki-67 expression and apoptosis in cyclosporin A-induced gingival overgrowth[J].JPeriodontol,2007,78(2):282-289.

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    [9] 詹啟敏.分子腫瘤學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:403-425.

    ZHAN Qi-min.Molecular oncology[M].Beijing:People’s Medical Publishing House,2005:403-425.

    [10] Wondimu B,Reinholt FP,Modeer T.Sterologic study of cyclosporin A-induced gingival overgrowth in renal transplant patient[J]. Eur J Oral Sci,1995,103(4):199-206.

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    [12]劉培紅,馬肅,劉薇婷.環(huán)孢素對大鼠牙齦組織形態(tài)影響的定量分析[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,27(6):599-602.

    LIU Pei-hong,MA Su,LIU Wei-ting.Quantitative analysis the effect of Ciclosporin on gingival tissue modality of rats[J].West China J Stomatol,2009,27(6):599-602.

    (本文編輯 湯亞玲)

    Apoptosis and expression of Bcl-2 and Caspase-3 in Ciclosporin-induced gingival overgrow th of rats

    LIU Pei-hong1,MA Su1,CHEN Li2.(1.Dept.of Periodontology,College of Stomatology,Harbin Medical University,Harbin150001,China;2.Dept.of Scientific Research,The First Clinical College of Harbin Medical University,Harbin150001,China)

    ObjectiveTo observe the effect of Ciclosporin(CsP)on apoptosis and expression of the associated protein Bcl-2,Caspase-3 in gingival epithelium of rats in order to approach the mechanism of CsP-induced gingival epithelium overgrowth.MethodsEighty SPF grade male 7-week-old Wistar rats were random ly divided into experimental group and control group,and each group was divided into 4 subgroups according to the duration of treatment(10, 20,30 and 40 days).The experimental objects were given fresh milk including CsP intragastrically and the control ones were given only fresh milk.After perfusion of 4%paraform for internal fixation,the specimens’bucco-lingual paraffin sections at lower first molar were made.Apoptosis was detected using TdT-mediated dUT nick end labeling(TUNEL)and the expression of Bcl-2 and Caspase-3 using immunohistochemisty of PV.The apoptotic index,positive cell rate of Caspase-3 and average gray scale of Bcl-2 wasmeasured with an image analysis system.Data were analyzed by two-way analysis of variance of factorial design.Results The apoptosis index and positive cell rate of Caspase-3 were downregulated in the experimental group,and were significant difference from the control group(P<0.05).The average gray scale of Bcl-2 was up-regulated in the experimental group,and was significant difference from the control group(P<0.05). Conclusion CsP-induced gingival epithelial overgrowth is likely to associated with interference to the path of mitochondrial apoptosis and inhibition apoptosis.

    Ciclosporin; drug-induced gingival overgrowth; cell apoptosis

    R 781.3

    A

    10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.023

    1000-1182(2011)03-0310-04

    2010-10-27;

    2011-02-15

    黑龍江省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(2006-009);哈爾濱市科技局優(yōu)秀學(xué)科帶頭人研究專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2009RFXXS214)

    劉培紅(1976—),女,黑龍江人,主治醫(yī)師,碩士

    馬肅,Tel:0451-85553988

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