磷脂脂肪酸法分析野山參根區(qū)土壤微生物群落多樣性

張亞玉，宋曉霞，孫 海，汪景寬，于 樹*

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 吉林 132109；2.沈陽農業(yè)大學土壤與環(huán)境學院，沈陽 110161）

野山參（Wild ginseng）為五加科人參屬多年生草本植物，其根為道地中草藥，吉林省東部山區(qū)被認為是人參最適宜的生長區(qū)，而撫松縣被譽為“人參之鄉(xiāng)”，自古就是人參的主產區(qū)，出產優(yōu)質野山參。野山參是指自然生長在原始森林中，沒有人為因素影響的一類人參。野山參的藥用價值極高，早在2000年前，《神農本草經》中對野山參的藥用價值就有了詳細的記載，《本草綱目》中稱野山參為“神草”，列為藥中上品，具有生津安神、補虛固脫、大補元氣、強精健身益壽延年之功效[1]。但隨著對野山參無度采挖，導致目前野山參資源瀕于滅絕的地步。而林下參和農田栽參的發(fā)展既是對山參資源的保護，又可滿足人們對人參產品的需求，也為參農提供了治富之路，為農村產業(yè)結構調整提供了新的思路。但在林下參發(fā)展過程中由于選地不當，林下參的存苗率低，形體變劣的現象時有發(fā)生；農田栽參過程中由于改土不當，存在產量低、病害重，且存在嚴重的連作障礙，限制了參業(yè)的發(fā)展，而上述問題的產生均與土壤的物理、化學及微生物特性等關系密切[2-4]。通過對栽參土壤和老參地土壤的微生物及酶活性的研究，多數專家提出土壤微生物群落的改變可能是人參連作障礙的根源。野山參在深山密林中生長十年、幾十年甚至上百年，其能夠安然無恙，與其特有的土壤微生物群落特性直接相關。前人對于人參土壤微生物的研究多采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，由于可培養(yǎng)的微生物種類僅占土壤微生物的1%左右，所以對于微生物的真實性存在一定的誤差，而磷脂脂肪酸PLFA方法是一種快速、重現性好的分析土壤微生物群落結構多樣性的方法，可以分析所有活體微生物（包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物）。而且，信息準確度高，應用范圍廣，操作簡便，可以同時處理大量的樣品，是對土壤中活體微生物的真實反映[5-8]。本文利用磷脂脂肪酸法通過對野山參根區(qū)土壤微生物結構特性與非根區(qū)土壤微生物群落的對比分析，明確山參根區(qū)土壤的微生物結構特征，期望能在農田栽參土壤改良和林下參護育選地方面提供幫助，為人參產業(yè)的健康發(fā)展提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采自吉林省人參之鄉(xiāng)的撫松縣露水河鎮(zhèn)楞場村，離村5 km的黑熊溝山上，1號（大約12年生）野山參土壤位于東經127°44′、北緯42°47′、海拔（780±9）m，2號（大約25年生）野山參位于東經127°57′、北緯42°33′、海拔（650±5）m，采集地土壤類型為暗棕壤，該區(qū)是野山參經常被發(fā)現的地域。

1.2 采樣方法

首先除去表面的枯枝落葉層后，邊抬參邊取土，由于野山參生長的特殊性，每年在生長期其須根周圍均長出許多營養(yǎng)吸收根，枯萎期時有的脫落，有的在須根上形成珍珠點，使野山參根圈土壤可以擴展到須根周圍2 cm左右的范圍，對照為非根區(qū)土壤，在附近采集，采集深度與參層土壤樣品相對應。取回的新鮮土樣放入4℃的冰箱貯存待測。野山參根區(qū)土壤的基本性質見表1。

表1 供試土壤基本性質Table1 Some basic properties of tested soil

1.3 測試方法

土壤微生物磷脂脂肪酸的測定在White的方法[9]上加以改進。①鮮土加入檸檬酸緩沖液∶氯仿∶甲醇=0.8∶1∶2，25℃避光震蕩，離心。再加入檸檬酸緩沖液∶氯仿∶甲醇=0.9∶1∶1，震蕩，避光保存，經18 h分離后，用吸管把上層液吸走，保留底層氯仿相在氮氣流下吹干。②用柱層析硅膠0.8 g（在120℃下烘干2 h）填充玻璃管柱（直徑6 mm），依次分別加10mL氯仿、10mL丙酮、10mL甲醇，收集到的磷脂脂肪酸在甲醇相中，在氮氣流下吹干樣品。③向干樣品中加入1mL甲醇∶甲苯（1∶1）混合液和1mL 0.2 mol·L-1KOH甲醇溶液，37℃水浴15 min后，冷卻至室溫，依次加入2mL去離子水，0.3mL 1 mol·L-1HAc，2mL正己烷，震蕩，離心，甲酯化的C19:0為內標，氮氣流下吹干，-20℃下保存。外標為SupelcoTM37 Component FAME Mix和Bacterial Acid Methl Esters Mix。

檢測部分由安捷倫GC-MS（6890 N-5973 N）完成。色譜柱為hp5-MS（30 m×250 um×0.25 um）石英毛細管柱。GC-MS分析條件:升溫程序:進樣后在70℃保持5 min，之后以20℃·min-1的速率升至190℃，保持1 min，以5℃·min-1的速率上升到200℃，停留2 min，以10℃·min-1的速率上升到280℃，保留8 min。進樣口溫度為250℃，載氣為He（0.9mL·min-1），分流比為 10∶1，離子源溫度230℃，四極桿:150℃，質譜全掃描范圍:30～600 m·z-1。

1.4 數據分析

應用Excel、SAS軟件進行方差分析和PLFAs主成分分析。其中c、t、i和a分別表示順勢雙鍵、反勢雙鍵、順勢支鏈、反勢支鏈；br表示不確定支鏈位置，Me表示甲基位置，cy表示環(huán)丙基。結果見表2。

表2 磷脂脂肪酸的代表生物Table2 Biomarkers of some microbial groups in soil

2 結果與分析

本試驗共測得1號土壤中的脂肪酸23種，2號土壤中脂肪酸19種，根區(qū)土壤與非根區(qū)土壤微生物所含脂肪酸種類基本相同。

2.1 野山參根區(qū)土壤的微生物PLFA圖譜的特征

結果見圖1、2。本研究鑒定的PLFAs，C鏈長度為14～24，包括飽和、不飽和、甲基化分支和環(huán)化脂肪譜，在野山參根區(qū)土壤的PLFAs中，i15:0，a15:0，i16:0，16:1w9c，16:1w9t，16:0，br17:0，i17:0，cy17:0，18:2w9，18:1w9c，18:1w9t等13種PLFAs在1號野山參土壤微生物豐度占97.28%，2號野山參中占84.89%，是山參根區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要生物成分。同時發(fā)現，野山參根區(qū)土壤微生物總量與非根區(qū)土壤微生物總量相比，均有下降的趨勢。，野山參根區(qū)土壤的微生物組成也有所改變，對比所獲得的野山參樣品，1號野山參生長健康，無發(fā)病癥狀，研究1號根區(qū)土壤的微生物組成發(fā)現，根區(qū)中代表致病因素的真菌18:2w9，18:1w9c，18:1w9t的數量與對照相比明顯減少，而代表放線菌種類的10Me17:0卻明顯增加；由于在人參生產中，真菌病害的發(fā)生較為常見，2號野山參雖然年限較長，但身體已經發(fā)生銹變的癥狀，可能與其根區(qū)土壤的微生物變化有著直接的關系，與對照相比，微生物的量雖然有減少的趨勢，但代表真菌18:1w9c，18:1w9t減少的程度并不顯著，有益微生物沒有增加均在減少，這與農田土壤的微生物群落結構的變化與病害的發(fā)生直接相關相一致。

2.2 野山參根區(qū)土壤微生物的群落結構

通過PLFAs主成分分析可明顯的區(qū)分野山參根區(qū)土壤與對照土壤（見圖3），根區(qū)土壤在坐標軸附近，而對照土壤則遠離坐標軸，說明野山參根區(qū)土壤微生物脂肪酸的組成和主成分一、二間的相關性不大或成負相關[12-13]。3個主成分得分解釋了81.03%和85.44%的變異。主成分一（PC1）解釋了36.54%和39.09%的變異，主成分二（PC2）解釋了28.65%和29.91%的變異，主成分三（PC3）解釋了15.83%和16.43%的變異，在測試的野山參根區(qū)土壤樣品中，PC1得分均比對照低。主成分一、二的因子分析表明i15:0，a15:0，16:1w9c，i17:0與主成分一呈高度正相關，而16:1w9t，16:0，br17:0，17:0（10Me），cy17:0，18:0（10Me）18:2w9，18:1w9c，18:1w9t與主成分成高度負相關，也就是與根區(qū)土壤的微生物群落結構直接相關。從對兩份土樣的分析看，野山參生長根區(qū)土壤微生物群落組成發(fā)生了改變，盡管兩份樣品采自不同的山上，但根區(qū)土壤的微生物群落的變化卻有相似的發(fā)展趨勢。

圖1 1號野山參PLFAs圖譜Fig.1 PLFAs profile of tested No.1 soil

圖2 2號野山參PLFAs圖譜Fig.2 PLFAs profile of tested No.2 soil

圖3 PLFAs主成分分析圖譜Fig.3 Principle components analysis of PLFA profiles from microbe

3 討 論

PLFAs在研究比較復雜環(huán)境中微生物群落組成方面應用廣泛[14]，PLFAs的變化可以很好地反映野山參根區(qū)土壤微生物的變化，研究證明野山參根區(qū)土壤微生物脂肪酸圖譜與對照相比發(fā)生明顯的改變，野山參根區(qū)土壤的微生物總量明顯減少，代表真菌生物的18∶2w9，18∶1w9c，18∶1w9t總量與對照相比有減少的趨勢，這一結果有別與以往的相應研究。產生這一現象的原因可能與野山參的生長有直接關系，野山參在一地生長10年、20年甚至幾十年，不感病，也不出現平地栽參的連作障礙，特有的根區(qū)土壤微生物群落特性可能是其健康生長的直接原因。

對于土壤微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，土壤微生物可培養(yǎng)的總量不足全部微生物的1%。分離結果不能夠反映土壤微生物的真實情況，利用PLFA分析發(fā)法可以培養(yǎng)幾乎土壤中全部的活體微生物，能夠比較準確的反映土壤微生物的群落結構特征[15]，對野山參根區(qū)土壤所測得的23種PLFAs代表了土壤的細菌、真菌和放線菌，是野山參根區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要成分。結合以往對于栽培人參土壤微生物真菌培養(yǎng)研究的結果，在方法上為解決制約農田栽參和老參地的微生物改造方面提供了方法指導。由于野山參資源的瀕臨滅絕，其根區(qū)土壤的獲得也較為珍貴，通過了解野山參根區(qū)土壤微生物群落特征，可以為農田栽參土壤改良提供科學指導。為人參產業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供新的理論支持。

[1]何永明.人參本草史考證[J].中成藥,2001,23(5):384-386.

[2]賈書剛,王淑平,竇森.栽培人參對床土化學性質的影響[J].吉林農業(yè)大學學報,1992,14(2):42-46.

[3]竇森,張晉京,江源,等.栽參對土壤化學性質的影響[J].吉林農業(yè)大學學報,1996,18(3):67-73.

[4]于得榮,趙壽經,曹秀英,等.農田土壤與高產人參腐殖土壤的理化性狀對比研究[J].土壤學報,1990,27(2):228-232.

[5]宋曉霞,張亞玉,孫海.人參與西洋參土壤脲酶活性對比研究[J].特產研究,2008(2):33-35.

[6]張亞玉,宋曉霞,孫海.栽培人參、西洋參不同年限土壤酸堿度和酶活性的變化研究[J].特產研究,2008(4):33-35.

[7]白震,何紅波,張威,等.磷脂脂肪酸技術及其在土壤微生物研究中的應用[J].生態(tài)學報,2006,26(7):2387-2393.

[8]焦曉丹,吳鳳芝.土壤微生物多樣性研究方法的進展[J].土壤通報,2004,35(6):789-792.

[9]White D C,Stair J O,Ringelberg D B.Quantitative comparisons of in situ microbial biodiversity by signature biomarker analysis[J].Joumal of Industry Microbiology,1996,17:185-196.

[10]Zelles L.Identification of single cultured microorganisms based on their whole community fatty acid profiles using extraction proce-dure Chemosphere,1999,39:665-682.

[11]Hamel C,Vujanovic V,Jeannotte R,et al.Negative feedeback on a perennial crop:Fusarium crown and root of asparagus is related to changes in soil microbial com-munity structure.Plant and Soil,2005,268:75-87.

[12]Blume E,Bischoff M,Reichert J M,et al.Surface and subsurface microbial biomass,community structure and metabolic activity as a function of soil depth and season.Appl Soil Ecol,2002,20:171-181.

[13]Justin B B,Myrold D D,Sulzman E W.Root control on soil microbial community structure in forest[J].Oecologia,2006,148(4):650-659.

[14]祁建軍,姚槐應,李先恩,等.磷脂脂肪酸法分析地黃根際土壤微生物多樣性[J].土壤,2008,40(3):448-454.

[15]于樹,汪景寬,李雙異.應用PLFA方法分析長期不同施肥處理對玉米地土壤微生物群落結構的影響[J].生態(tài)學報,2008,28(9):4222-4227.