凍融胚胎植入前遺傳學(xué)篩查的研究

李曉曄 白曉紅

天津醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)中心(300052)

在體外受精 -胚胎移植(IVF-ET)周期中易發(fā)生染色體異常,尤其是出現(xiàn)非整倍體改變,在高齡婦女中尤其突出[1]。染色體的非整倍體改變是導(dǎo)致胚胎移植后受孕率和著床率低而流產(chǎn)率高的重要原因之一。本研究通過熒光原位雜交(FISH)方法檢測(cè)體外受精胚胎的 18及 X/Y等染色體的單體、三體、多倍體等異常分布情況,探討 FISH技術(shù)對(duì)植入前胚胎進(jìn)行常見染色體異常診斷的可行性與實(shí)用性,以及影響胚胎染色體異常的可能因素。

1 材料與方法

1.1 材料

選取 2007～2009年在本生殖中心凍存的 42枚正常胚胎,經(jīng)患者夫婦知情同意后將其解凍。IVF組胚胎 24枚,卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)組胚胎 18枚。女方年齡 31.41±5.17(26～42)歲,男方年齡34.23±4.58(24～43)歲。按病因分類為輸卵管因素 18例(42.85%),男方少弱精癥 14例(33.33%),排卵障礙 6例(14.29%),雙方因素 4例(9.52%)。

1.2 主要試劑及來源

胚胎解凍及培養(yǎng) ：G-IVF、HSA-solution、解凍液等均購自 Sigma公司;卵裂球固定：Tyrode酸性液購自 Sigma公司;PBS干粉、牛血清白蛋白(BSA)、乙酸鈉、Tween-20均購自天津市康科德科技有限公司;濃鹽酸、甲醇、冰乙酸等購自天津市北辰區(qū)柳灘工業(yè)區(qū);FISH試劑：FISH DNA探針、雜交緩沖液、DAPI復(fù)染劑購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司;NP-40購自 Sigma公司;20×SSC、2×SSC、無水乙醇和氫氧化鈉(NaOH)購自天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3 方法

1.3.1 卵裂球活檢 ①胚胎解凍后移入無 Ca2+,Mg2+的 PBS微滴中,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10min;②將胚胎轉(zhuǎn)移入 G-IVF培養(yǎng)液微滴中,清洗兩次后移入 pH 2.2 Tyrode液中消化透明帶;③將酸性液清洗干凈后,用毛細(xì)玻璃管反復(fù)吹打胚胎,直到卵裂球完全裂開,吸取單個(gè)卵裂球;④活檢出的卵裂球移入置乙酸鈉微滴的培養(yǎng)皿中低滲 5min。每個(gè)胚胎活檢后剩余卵裂球均與活檢卵裂球行同樣操作。

1.3.2 卵裂球細(xì)胞固定 用口吸管將單個(gè)卵裂球移至 0.1%Tween-20/0.01M HCl裂解液中,并以裂解液為輔展液迅速轉(zhuǎn)移至載玻片標(biāo)定區(qū)域內(nèi)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞膨脹、破裂、核游離情況。自然干燥后固定。

1.3.3 FISH ①避光條件下制備探針混合物;②置 75℃水浴中共變性;③42℃溫箱雜交過夜;④洗脫非特異性雜交;⑤ DAPI復(fù)染;⑥熒光觀察和結(jié)果判斷：應(yīng)用 FISH 2.0分析軟件進(jìn)行圖像分析。CSP18、CSPX和 CSPY激發(fā)信號(hào)分別呈藍(lán)色、綠色和紅色。細(xì)胞核中出現(xiàn) 2個(gè)熒光信號(hào)為二體型胚胎,出現(xiàn)一個(gè)信號(hào)為單體型胚胎,出現(xiàn)≥3個(gè)信號(hào)為多體型胚胎。若同一胚胎中每個(gè)卵裂球雜交信號(hào)一致,則認(rèn)為整個(gè)胚胎為該染色體核型;有雜交信號(hào)而卵裂球間出現(xiàn)的信號(hào)不一致,則該胚胎為嵌合體。

1.3.4對(duì)照實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取 2010年 6～12月本院產(chǎn)前診斷中心唐氏綜合征(DS)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦 20例。B超引導(dǎo)下行經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水 20m l,其中 15m l行染色體核型分析,羊水細(xì)胞培養(yǎng)制片、G顯帶,并按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN,1995)進(jìn)行核型分析;余 2～3m l經(jīng)低滲、固定處理后,直接與固定好的單個(gè)卵裂球細(xì)胞在相同條件下行 FISH檢測(cè)。計(jì)數(shù)至少 100個(gè)細(xì)胞,異常細(xì)胞比例 ＞60%,提示該樣本異常;異常細(xì)胞比例 ＜10%,提示該樣本無異常;如果異常細(xì)胞比例 10%～60%,加大觀測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)目,如實(shí)記錄異常細(xì)胞比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用±s表示,采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 FISH與核型分析結(jié)果的一致性

核型分析結(jié)果顯示,20例羊水細(xì)胞培養(yǎng)均成功,檢測(cè)出異常核型 1例：47,XXY。FISH分析結(jié)果顯示,20例羊水標(biāo)本均出現(xiàn)清晰雜交信號(hào)并成功分析得出結(jié)果,成功率 100%,1例樣本指標(biāo)異常(47,XXY),與核型分析一致。FISH的非整倍體敏感性為 50%,特異性為 100%,與核型分析的符合率達(dá) 95%。

2.2 胚胎活檢和卵裂球固定情況

共獲取單個(gè)卵裂球 39個(gè),均細(xì)胞完整、胞核清晰,活檢成功率為 92.86%(39/42)。剩余卵裂球 73個(gè),全部進(jìn)行 FISH檢測(cè)。共 112只卵裂球細(xì)胞,成功固定了 97個(gè),固定成功率為 82.61%(97/112)。

2.3 卵裂球細(xì)胞的雜交情況

固定成功的 97只卵裂球中,90只可見熒光信號(hào),雜交成功率為 92.78%(90/97)。

2.4 受精方式與胚胎染色體異常的關(guān)系

IVF組與 ICSI組嵌合體及染色體異常發(fā)生率見表 1,兩組胚胎染色體異常率(χ2=0.198,P＞0.05)和嵌合體發(fā)生率(χ2=1.206,P＞0.05)比較,均無明顯差異。

表 1 受精方式與胚胎染色體異常的關(guān)系

2.5 年齡、超促排卵(COH)方案與胚胎染色體異常的關(guān)系

將所有患者以年齡 35歲為界分為兩組,年齡≥35歲組染色體異常率(56.52%)高于 ＜35歲組(34.78%),但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.768,P=0.184)。兩組嵌合率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(43.75%vs 17.39%,χ2=6.865,P＜0.05)應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長方案的胚胎染色體異常率(35.29%)與應(yīng)用短方案(45.45%)的比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.666,P＞0.05)。

2.6 促性腺激素(Gn)用量和 Gn給藥天數(shù)與染色體異常的關(guān)系

Gn用量為 23.98±9.171支,Gn用藥天數(shù)為9.02±1.248天。按 Gn用量分為≥20支和 ＜20支兩組;按 Gn給藥天數(shù)分為≥9d和 ＜9d兩組。由表 2可知,Gn用量與染色體異常的發(fā)生關(guān)系較密切(χ2=4.744,P=0.029),而 Gn給藥天數(shù)對(duì)染色體異常的發(fā)生無明顯影響(P＞0.05)。

表 2 Gn用量和 Gn給藥天數(shù)與染色體異常的關(guān)系

3 討論

雖然單周期 IVF-ET技術(shù)的臨床妊娠率己高達(dá)60%,總體妊娠率卻依然較低。為了提高 IVF-ET成功率,降低染色體病患兒出生率,對(duì)胚胎染色體進(jìn)行非整倍體篩查,選擇最佳胚胎移植顯得十分必要,因?yàn)榕咛ベ|(zhì)量與染色體整倍體性相關(guān),胚胎質(zhì)量越差,染色體異常率也越高[2]。在 IVF周期中,首選正常受精且質(zhì)量較好的胚胎進(jìn)行移植,然而盡管有些胚胎有較好的外形及發(fā)育程度,但因其染色體異常,仍導(dǎo)致移植失敗。Baart等[3]于 2006年利用 FISH方法研究了年輕女性胚胎的 10條染色體,發(fā)現(xiàn)僅 36%的胚胎有正常二倍體狀態(tài)。本研究中所選樣本均為正常受精的優(yōu)質(zhì)凍存胚胎,理論上染色體應(yīng)該為正常的二倍體核型,但結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)凍存胚胎的染色體異常率約為 35.90%,二倍體率為 64.10%,與 Baart等的研究結(jié)果一致。另外,我們選擇的研究對(duì)象是正常凍存胚胎,解凍后也可能有一定程度的染色體畸變[4]。

35歲以上,尤其 40～45歲女性卵細(xì)胞的染色體非整倍體率明顯上升,確切原因尚不清楚,可能與高齡女性卵細(xì)胞的紡錘體老化和同源染色體間的交叉互換減少有關(guān)[5],也可能與環(huán)境中各種物理、化學(xué)、生物等不良因素的積累效應(yīng)有關(guān)。且各種環(huán)境因素均可引起卵細(xì)胞的減數(shù)分裂異常,長期綜合作用所產(chǎn)生的累積效應(yīng)對(duì)高齡女性卵細(xì)胞產(chǎn)生的影響較年輕女性大[6]。本研究中,高齡患者的染色體異常嵌合率明顯增高。因而對(duì)于35歲以上行 IVF-ET治療的女性,應(yīng)做好遺傳咨詢工作,建議對(duì)其胚胎或卵細(xì)胞進(jìn)行染色體非整倍體的植入前診斷。故提高非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷水平,在當(dāng)前尤為重要。

COH方案對(duì)胚胎染色體異常的影響不明確。Gn用量則能影響染色體異常的發(fā)生率。本研究結(jié)果顯示,促排卵藥物劑量越大,胚胎染色體異常率越高。有研究表明,體外成熟(IVM)培養(yǎng)過程中,高濃度的卵泡刺激素(FSH)可明顯提高第一次減數(shù)分裂的錯(cuò)誤幾率,從而出現(xiàn)更多的非整倍體卵母細(xì)胞[7]。Roberts等[8]對(duì) IVM過程中的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行研究,結(jié)果表明暴露在高濃度 FSH中的卵母細(xì)胞核成熟率提高得非常明顯,而胞漿成熟缺陷可能導(dǎo)致卵裂時(shí)的紡錘體缺陷,增加其非整倍體發(fā)生率和染色體異常發(fā)生率。另外,COH過程中患者體內(nèi)激素水平發(fā)生巨大改變,卵泡液中激素水平的改變會(huì)影響卵子質(zhì)量,較高的雌激素可能在 ICSI時(shí)影響卵子的正常受精[9]。

受精方式可能會(huì)影響胚胎染色體異常情況。ICSI技術(shù)是一種有創(chuàng)性操作,向卵母細(xì)胞注入精子的同時(shí),可能會(huì)造成細(xì)胞骨架或紡錘體的損傷,而人為的精子選擇不當(dāng)、外源性物質(zhì)的侵入等也會(huì)導(dǎo)致胚胎染色體異常的形成機(jī)會(huì)增加;非 ICSI技術(shù)因素,如有遺傳學(xué)方面缺陷的精子,可能會(huì)避開自然篩選和淘汰的過程直接將缺陷垂直遺傳給子代[10]。Retzloff等[11]卻認(rèn)為常規(guī) IVF獲得的胚胎和 ICSI獲得的胚胎染色體異常率無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。本研究中也未得出某種受精方式會(huì)增加胚胎染色體異常的結(jié)論。因此,關(guān)于受精方式對(duì)染色體異常情況的影響,仍需要進(jìn)一步大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

嵌合體在人類植入前胚胎中很常見,可能是影響 IVF-ET周期成功率的重要因素之一。產(chǎn)生機(jī)制仍不明確,應(yīng)該是在胚胎發(fā)育過程中,減數(shù)分裂發(fā)生錯(cuò)誤,導(dǎo)致染色體丟失。Ren等[12]發(fā)現(xiàn)在正常受精但不適宜移植和冷凍的胚胎中 31.4%是嵌合體。由于胚胎的來源和選用的探針不同,在各種報(bào)道中,嵌合型胚胎的比例也不甚相同。但能確定的是,隨著胚胎的發(fā)育,細(xì)胞連續(xù)分裂次數(shù)的增多,發(fā)生分裂錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)增加,發(fā)生染色體嵌合的機(jī)會(huì)也增加。在人類正常受精的胚胎中,染色體嵌合現(xiàn)象非常普遍,有可能導(dǎo)致胚胎種植前遺傳學(xué)診斷(PGD)的誤診,并降低 PGD的準(zhǔn)確性[13]。本研究顯示,胚胎的嵌合率為 20.51%,較之前研究比率偏低,可能與檢測(cè)的染色體數(shù)目較少有關(guān)。Baart等[14]發(fā)現(xiàn)篩查更多的染色體可能提高異常胚胎的檢出率。但是由于嵌合體胚胎移植后的結(jié)局也尚未明確,臨床植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)中額外檢查其他染色體的價(jià)值仍不明確。

傳統(tǒng)的 PGD診斷直接對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增,較 FISH方法更經(jīng)濟(jì)。但由于 DNA模板量少,難以滿足一個(gè)基因多種突變、多個(gè)基因檢測(cè)以及對(duì)結(jié)果行重復(fù)性驗(yàn)證的需要,最突出的問題是擴(kuò)增失敗、等位基因脫扣和易受到其他 DNA序列的污染。雖然FISH方法花費(fèi)較高,增加了不孕患者的負(fù)擔(dān),但在遺傳學(xué)診斷中利用 FISH法對(duì)植入前胚胎的染色體進(jìn)行分析有較高的準(zhǔn)確性,可以篩選高質(zhì)量的胚胎,以利于提高植入率;可以避免性染色體異常以及三體患兒出生;還可以對(duì)患有遺傳學(xué)疾病夫婦的胚胎進(jìn)行篩選,排除病變胚胎,避免將疾病遺傳給子代。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,FISH技術(shù)已得到不斷改進(jìn)和完善,靈敏度和分辨率不斷提高,已成為生殖醫(yī)學(xué)以及遺傳學(xué)領(lǐng)域中極為重要的研究和檢查手段。

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