升陷湯加味方對兔病態(tài)竇房結(jié)綜合征影響的實驗研究*

張 軍，劉玉潔，吉 麗，管建存，程 菲，張 倩

病態(tài)竇房結(jié)綜合征(Sick sinus syndrome，SSS)是由于竇房結(jié)及其鄰近組織器質(zhì)性病變引起的竇房結(jié)起搏功能和(或)傳導(dǎo)障礙，從而產(chǎn)生多種心律失常和臨床癥狀的綜合征，屬心血管系統(tǒng)常見性、難治性疾病。我們在長期臨床實踐中，依據(jù)病態(tài)竇房結(jié)綜合征臨床表現(xiàn)，結(jié)合中醫(yī)學(xué)理論及古代醫(yī)家思想，組成升陷湯加味方治療本病并取得了顯著療效。本實驗擬通過升陷湯加味方預(yù)處理對兔病態(tài)竇房結(jié)綜合征模型的影響來探討其作用機(jī)制，為升陷湯加味方治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

日本大耳白兔30只，華北煤炭醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，體重2.5 kg～3.5kg，雌雄不拘，許可證SCXK(京)2007-0003。實驗前實驗性飼養(yǎng)5d。

1.2 試劑

25%烏拉坦，20%甲醛溶液，冰醋酸(分析純)，Na+-K+ATP酶測試盒、SOD測試盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，4%多聚甲醛、梯度酒精(60%、70%、80%、90%、95%、1 00%)、香柏油、二甲苯、固體石蠟、蘇木素染液、伊紅染液。

1.3 主要儀器

BL－420生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟)，針形四極心電電極，自制棉簽(2mm×2mm×3mm左右)，動物人工呼吸機(jī)DH－140(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實驗廠)，F(xiàn)A2004電子天平(上海天平儀器廠)，組織勻漿機(jī)(IKA-T8:Germany)，80-2離心沉淀器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，SHZ-88水浴恒溫振蕩器(常州翔天實驗儀器廠)，722S可見分光光度計(上海精密儀器有限公司)，切片機(jī)和光學(xué)顯微鏡。

1.4 藥物

升陷湯加味方組成:黃芪 30g，知母 10g，柴胡6g，桔梗 10g，升麻 6g，黨參 18g，山萸肉 20g，桂枝10g，炙甘草10g，羌活10g。采用廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的顆粒劑(相當(dāng)于上述藥物原生藥飲片劑量);心寶丸(60mg/丸，星辰牌，廣東真和新君寶藥業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

2.1.1 分組 將30只日本大耳白兔隨機(jī)分成空白組(A組)、模型組(B組)、心寶對照組(C組)、升陷湯加味方高劑量組(D組)、升陷湯加味方中劑量組(E)、升陷湯加味方低劑量組(F組)6組，每組5只。

2.1.2 給藥 每組于造模前先連續(xù)給藥7d，每天1次，藥物預(yù)處理組給藥劑量按人與兔用藥量換算方法［1］得出:A組:經(jīng)口灌服蒸餾水15ml/d×7d;B組:經(jīng)口灌服蒸餾水15ml/d×7d;C組:經(jīng)口灌服心寶混懸液0.18g/kg.d×7d(與蒸餾水15ml/d制成混懸液);D組:經(jīng)口灌服升陷湯加味方顆粒劑86.2g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸餾水);E組:經(jīng)口灌服升陷湯加味方顆粒劑43.1g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸餾水);F組:經(jīng)口灌服升陷湯加味方顆粒劑21.5g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸餾水);每組給藥7d后進(jìn)行模型制備手術(shù)。

2.1.3 模型制備 取健康大耳白兔30只，稱重后用25%烏拉坦(1g/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉，背位固定于動物手術(shù)臺上，連接BL－420生物機(jī)能實驗系統(tǒng)。頸部及胸前剪毛，消毒手術(shù)區(qū)。頸部氣管切開備用連接呼吸機(jī)，沿胸骨右緣縱向切開皮膚長約2cm，打開胸腔，避免損傷右側(cè)胸膜，經(jīng)縱隔打開心包，充分暴露心臟。持續(xù)心電、呼吸監(jiān)護(hù)。實驗組用20%甲醛溶液浸濕大小約2mm×2mm×3mm棉簽并置于竇房結(jié)區(qū)(上腔靜脈與右心房交界處)［2］濕敷，連續(xù)監(jiān)測心電圖變化并記錄其HR。空白組只行開胸手術(shù)，不行甲醛濕敷手術(shù)。以濕敷后HR較濕敷前下降30%以上或出現(xiàn)竇性停搏、竇房阻滯及(或)結(jié)性逸搏心律為竇房結(jié)組織急性損傷模型成功的標(biāo)志［3］。當(dāng)出現(xiàn)上述現(xiàn)象時即停止?jié)穹?，對未出現(xiàn)上述現(xiàn)象者再持續(xù)濕敷5min，直到出現(xiàn)為止。

2.2 指標(biāo)測定

2.2.1 心率的測定 記錄造模前、模型制備成功后 5min、30min、60min、120min 基礎(chǔ)竇性心率變化情況及空白組實驗過程中相應(yīng)各時間點的心率。

2.2.2 竇房結(jié)功能測定 竇房結(jié)恢復(fù)時間(SNRT)的測定:采用分級遞增刺激法，以略大于基礎(chǔ)心率的頻率開始，之后以每次心率遞增20%的頻率分級刺激，直至SNRT不再延長為止。刺激時間為30s，間隔1min，刺激強(qiáng)度為2倍舒張域，脈寬0.3ms。計算方法:將心房刺激終止前的最后1個 P波至第1個恢復(fù)后的竇性P波時間為竇房結(jié)恢復(fù)時間，不論哪一個刺激頻率水平，取其最大值作為每只兔的竇房結(jié)恢復(fù)時間。校正竇房結(jié)恢復(fù)時間(SNRTc)測定:SNRTc=SNRT－基礎(chǔ)竇性周期長度(BCL)。竇房傳導(dǎo)時間(SACT)測定:采用 Narula法［4］以大于基礎(chǔ)心率10%的頻率刺激右心房，連續(xù)8次，刺激強(qiáng)度、脈寬同 SNRT測定。計算方法:SACT=(刺激后恢復(fù)間期－基礎(chǔ)竇性周期長度)/2。

2.2.3 心肌Na+-K+ATP酶測定 各組造模成功后2h，剪取心肌組織，迅速置于冰鹽水中反復(fù)沖洗，濾紙吸干水分，準(zhǔn)確稱重0.2g，加入組織重量9倍的冰鹽水，使用組織勻漿機(jī)1000r/min制成10%組織勻漿，1000r/min離心，取上清200μl用鹽水按1∶4稀釋成2%的組織勻漿，按試劑盒說明測定蛋白含量和Na+-K+ATP酶活力。

2.2.4 心肌SOD活力測定 取材及制備同Na+-K+ATP酶測定，取上清采用黃嘌呤氧化酶法，嚴(yán)格按試劑盒說明測定蛋白含量及SOD活力

2.2.5 竇房結(jié)病理切片觀察 實驗結(jié)束后剪取竇房結(jié)制作切片，光學(xué)顯微鏡觀察各組竇房結(jié)組織損傷情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，多組間均數(shù)比較做單因素方差分析，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組心率的變化情況

表1 各組心率的變化情況(珋x±s)(次/min)

表1顯示，造模前與造模后比較(除A組外)，各組心率均下降30%以下(P<0.05)，且于60min、120min時趨于穩(wěn)定，表明造模成功;與A組比較，B組、C組、D組、E組、F組造模后各時間點心率均下降(P<0.05);與B組比較，C組、D組、E組、F組造模后各時間點心率均上升(P<0.05);與C組比較，D組造模后各時間點心率下降不明顯(P>0.1)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，E組、F組變化明顯(P<0.05)。

3.3 各組心肌Na+-K+ATP酶活力、SOD活力的變化

表3 各組心肌Na+-K+ATP酶活力SOD活力的變化

3.2 各組竇房結(jié)電生理功能各項指標(biāo)變化

表2 各組竇房結(jié)電生理功能各項指標(biāo)變化(珋x±s)

表3顯示，與A組比較，其余各組 Na+-K+ATP酶、SOD活力均顯著降低(P<0.05);與 B組比較，C組、D組、E組、F組 Na+-K+ATP酶、SOD活力均升高(P<0.05);與C組比較，D組Na+-K+ATP酶、SOD活力變化不明顯(P>0.1)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而E組、F組變化顯著(P<0.05)。

3.4 竇房結(jié)病理切片觀察

表2顯示，與A組比較，其余各組各項電生理時間均顯著延長(P<0.05);與 B組比較，C組、D組、E組、F組各項電生理時間亦均顯著縮短(P<0.05);與C組比較，D組各項電生理時間變化不顯著(P>0.1)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，E組、F組各項電生理時間亦延長(P<0.05)。

觀察結(jié)果顯示，低倍鏡(×100)下模型組及各用藥組細(xì)胞腫脹，發(fā)生混濁變性，可見細(xì)胞排列紊亂，各組比較無明顯差異。高倍鏡下(×400)可見，細(xì)胞局灶性壞死，成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞排列紊亂。模型組大部分細(xì)胞都發(fā)生腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，粒細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞壞死，P、T細(xì)胞明顯減少;用藥組少量細(xì)胞腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，P、T細(xì)胞數(shù)量較模型組多。

4 結(jié)果

4.1 升陷湯加味方具有提高兔病竇綜合征模型心率的作用

觀察實驗組各時間點心率，與模型組比較，心寶組、升陷湯加味方高、中、低劑量組心率均顯著上升。結(jié)果表明，心寶及升陷湯加味方均能提高和改善心率，而升陷湯加味方高劑量組較心寶組心率下降不顯著(P>0.1)，中、低劑量組下降顯著(P<0.05)，說明升陷湯加味方高劑量能提高心率，效果與心寶相當(dāng)，且有劑量依賴關(guān)系。

4.2 升陷湯加味方可保護(hù)竇房結(jié)電生理功能

實驗各組在造模后 SNRT、SACT、SNRTc與空白組比較均有延長(P<0.05)，表明各組因甲醛濕敷而造成竇房結(jié)功能不同程度的受損。實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，各用藥組SNRT、SNRTc、SACT均顯著縮短，表明心寶及升陷湯加味方均能改善受損竇房結(jié)的自律性及其傳導(dǎo)功能;與心寶組相比，升陷湯加味方高劑量組 SNRT、SNRTc、SACT略有延長(P>0.1)，而中、低劑量組延長顯著(P<0.05)，提示升陷湯加味方高劑量具有與心寶相媲美的增強(qiáng)受損竇房結(jié)自律性及其傳導(dǎo)功能的作用，亦說明其作用與劑量相關(guān)。

4.3 升陷湯加味方可提高兔病態(tài)竇房結(jié)綜合征心肌Na+-K+ATP酶活力

Na+-K+ATP酶是細(xì)胞膜上普遍存在的一種離子驅(qū)動泵，在水解ATP的同時，能對抗細(xì)胞膜兩側(cè)電——化學(xué)梯度，維持膜內(nèi)外 Na+、K+的濃度差［5］，在維持細(xì)胞的生理活動、細(xì)胞正常代謝及細(xì)胞內(nèi)外離子平衡中起著重要作用。病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者常出現(xiàn)與心動過緩有關(guān)的心臟供血不足癥狀［6］，長時間心肌供血不足會導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜受損，甚或不可逆性損傷。本實驗在造模成功后2h剪取心肌組織并測定Na+-K+ATP酶活力。研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、各用藥組Na+-K+ATP酶活力顯著降低，提示20%甲醛濕敷手術(shù)可能造成心肌細(xì)胞受損，各用藥組較模型組Na+-K+ATP酶活力均明顯升高，其中升陷湯加味方高劑量組與心寶組Na+-K+ATP酶活力相當(dāng)，且高于升陷湯加味方中、低劑量組。此結(jié)果證實，升陷湯加味方確實能提高Na+-K+ATP酶活力，由此推斷升陷湯加味方可能具有減輕心肌細(xì)胞損傷、保護(hù)心肌的作用，其深入性機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

4.4 升陷湯加味方可提高心肌SOD活力

心動過緩而致的心肌缺血缺氧，可產(chǎn)生氧自由基生成過多，使心肌受到損傷。SOD是體內(nèi)清除氧自由基抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成成分之一，它能清除超氧陰離子，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷［7］。SOD活性越高則清除超氧陰離子及抗氧化能力越強(qiáng)，保護(hù)的效果越顯著。實驗結(jié)果表明，與空白組比較，其余各組SOD活力均顯著降低，表明心肌受損;與模型組比較，心寶組、升陷湯加味方高、中、低劑量組SOD活力顯著升高，說明各用藥組心肌具有自我保護(hù)能力;與心寶組相比，升陷湯加味方高劑量組SOD變化不顯著，中、低劑量組SOD活力明顯不及心寶組，因此升陷湯加味方高劑量具有更好的心肌保護(hù)效應(yīng)。

4.5 升陷湯加味方可保護(hù)竇房結(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

竇房結(jié)病理切片顯示，模型組發(fā)生大量細(xì)胞腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，粒細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞壞死，P、T細(xì)胞明顯減少;各用藥組少數(shù)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，P、T細(xì)胞減少數(shù)量較模型組少，表明用20%甲醛濕敷竇房結(jié)可以成功造成竇房結(jié)損傷模型，亦表明升陷湯加味方能夠增強(qiáng)竇房結(jié)細(xì)胞抗損害的能力。

圖1 使用升陷湯加味方后竇房結(jié)病理切片

圖2 模型對照組竇房結(jié)病理切片

5 結(jié)論

病態(tài)竇房結(jié)綜合征臨床表現(xiàn)多為緩慢性心律失常，癥見心悸、氣短、胸悶、頭暈甚至昏厥等，觀其脈象常以遲緩為主，中醫(yī)將其歸屬于“心悸”、“眩暈”、“胸痹”、“厥證”、“脈遲癥”等范疇。根據(jù)多年的臨床實踐，我們認(rèn)為本病的病機(jī)為大氣下陷、胸陽不振?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》:“氣虛宜掣引之?！惫蚀髿庀孪葑C的治療當(dāng)以升提胸中大氣、振奮心陽為主，因此以張錫純之升陷湯、張仲景的桂枝甘草湯作為基礎(chǔ)方加減化裁為升陷湯加味方。本動物實驗結(jié)果表明，升陷湯加味方預(yù)處理可提高兔病態(tài)竇房結(jié)綜合征模型的心率，保護(hù)竇房結(jié)功能，提高心肌SOD、Na+-K+ATP酶活力和竇房結(jié)細(xì)胞抗損害能力，其功效與劑量相關(guān)，高劑量效果更佳，為本藥的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù) 。

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