葛根芩連湯及其拆方對(duì)UC大鼠MTL、VIP的影響*

文穎娟，苗海東，張喜德，許愛英，王 江

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)又稱慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種病因不明的直腸和結(jié)腸炎性病變，具有病程漫長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作、并發(fā)癥多、預(yù)后較差等特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、伴濃液黏血便、里急后重等?，F(xiàn)代研究表明，UC主要由多種原因?qū)е聶C(jī)體和腸道免疫功能紊亂，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，形成潰瘍?cè)斐?病變限于黏膜及黏膜下層［1］。而葛根芩連湯(組成:葛根 15g，甘草 6g，黃芩 9g，黃連9g)是中藥治療腹瀉的經(jīng)典方劑，它早在張仲景·《傷寒論》中就用來治療濕熱所致的腹瀉和痢疾。

本實(shí)驗(yàn)擬通過建立UC大鼠模型，觀察通過葛根芩連湯及其拆方干預(yù)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠結(jié)腸組織中MTL、VIP的效用，進(jìn)而探討葛根芩連湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠MTL、VIP的影響機(jī)制，以期探索葛根芩連湯干預(yù)UC的作用機(jī)制以及君臣配伍在組方中的作用。

1 材料

1.1 藥物

葛根芩連湯(組成:葛根 15g，甘草 6g，黃芩 9g，黃連 9g，葛根、甘草、黃芩、黃連的比例為 5∶2∶3∶3)、葛根芩連湯去葛根方(組成:甘草 6g，黃芩 9g，黃連9g，甘草、黃芩、黃連的比例為 2∶3∶3)、葛根芩連湯去黃連方(組成:葛根 15g，甘草 6g，黃芩9g，葛根、甘草、黃芩的比例為5∶2∶3)、葛根芩連湯去葛根和黃連方(甘草 6g，黃芩 9g，甘草、黃芩的比例為2∶3)、葛根芩連湯去黃芩方(組成:葛根 15g，甘草 6g，黃連 9g，葛根、甘草、黃連的比例為 5∶2∶3)、葛根芩連湯去甘草方(組成:葛根 15g，黃芩 9g，黃連 9g，葛根、黃芩、黃連的比例為5∶3∶3)，以上中藥均購(gòu)自陜西省咸陽市和諧大藥房，在陜西中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室按常規(guī)煎法熬制成湯液，并分別濃縮成含生藥4.07g/ml、2.50g/ml、3.13g/ml、1.57g/ml、3.13g/ml、3.44g/ml的濃縮藥液備用。

1.2 動(dòng)物

健康SD大鼠(SPF級(jí))120只，雌雄各半，體重180～220g，由陜西省西安市西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證編號(hào) SCXK(陜)2007-001。給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為A組(正常組)、B組(病理組)、C組(葛根芩連湯全方組)、D組(葛根芩連湯去葛根組)、E組(葛根芩連湯去黃連組)、F組(葛根芩連湯去葛根和黃連組)、G組(葛根芩連湯去黃芩組)、H組(葛根芩連湯去甘草組)，每組各15只，各組體重統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無顯著差異。

1.3 主要試劑及儀器

5%2-4-6TNBS購(gòu)自上海達(dá)瑞化學(xué)品公司;乙醇、水合氯醛均購(gòu)自湖北大學(xué)化工廠;碘125I胃動(dòng)素放射免疫分析藥盒、碘125I血管活性腸肽放射免疫分析藥盒均購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。TG16-W型微量高速離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HH.W21.H20電熱恒溫水箱購(gòu)自天津斯泰特儀器有限公司;SN-697全自動(dòng)雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)儀(上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠)。

2 方法

2.1 造模方法

基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，A組繼前喂養(yǎng)。其余各組參考文獻(xiàn)［2、3］采用三硝基本磺酸(TNBS)/乙醇法建立UC模型;禁食24 h(不禁水)，10%水合氯醛腹腔麻醉，將TNBS 100 mg/kg+50%乙醇按照1∶1的比例混合，按1 ml/只用橡膠輸液管由大鼠肛門輕緩注入深約8 cm腸腔內(nèi)留置，次日即出現(xiàn)精神差、濕便等潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，表明造模成功。

2.2 給藥方法

造模后各組大鼠等條件下飼養(yǎng)，按成人每天1劑的藥量換算為大鼠每天每千克體重的用量，即給藥劑量均相當(dāng)于臨床用量的6.25倍。具體用量如下:C組按4.07g/kg/d藥物灌服葛根芩連湯水煎液，D組按2.50g/kg/d藥物灌服葛根芩連湯去葛根水煎液，E組按3.13g/kg/d藥物灌服葛根芩連湯去黃連水煎液，F(xiàn)組按1.57g/kg/d藥物灌服葛根芩連湯去葛根和黃連水煎液，G組按3.13g/kg/d藥物灌服葛根芩連湯去黃芩水煎液，H組按3.44g/kg/d藥物灌服葛根芩連湯去甘草水煎液(注:考慮到藥物損失最后一位小數(shù)采用進(jìn)位法，如C組計(jì)算值4.0625灌胃按4.07計(jì)算用藥量，其他各組均同)，B組即模型組按每10 g體重0.2 ml灌服蒸餾水。7組均每天灌服2次，連續(xù)4周后停藥。各組用藥過程中觀察大鼠飲食、精神、活動(dòng)度、飲水、濕便多少等情況。

2.3 結(jié)腸組織勻漿制備

各組大鼠腹腔麻醉后斷頸處死，剖開腹腔，摘取距回盲部2cm處的結(jié)腸組織100mg，縱行剖開，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，盡快加入1ml生理鹽水碾磨，制成 10%的組織勻漿，4℃3000r/min離心15min，留取上清液，－20℃保存待測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

放射免疫方法檢測(cè)結(jié)腸組織中MTL、VIP的含量，檢測(cè)方法參照試劑盒說明書，其單位為 pg/ml。

2.5 統(tǒng)計(jì)

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 各組用藥后癥狀

連續(xù)給藥4周后，各組用藥過程中觀察大鼠情況簡(jiǎn)述如下:A組(正常組)大鼠精神活躍、動(dòng)作敏捷、飲水、飲食良好、體重強(qiáng)加明顯。B組(模型組)大鼠懶動(dòng)、扎堆、拱背、飲水多、飲食較其他各組少、體重沒有增加甚至減輕、腹部有體毛脫落、大便為黏液稀便。C組大鼠精神較好、飲水、飲食正常、體重有所增加、給藥1周后黏液稀便消失。其他各組癥狀差別不明顯，與C組比較其他各組大鼠精神差、飲水多、飲食少、活動(dòng)差、體重增加不明顯、稀便程度不一。

3.2 葛根芩連湯及其拆方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中MTL的影響

表1顯示，與A組(正常組)比較，B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織中MTL的含量均明顯高于 A組;與 B組(模型組)比較，C組、D組、E組、F組、G組、H組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織中MTL的含量顯著降低(C組 P＜0.01，D組 P＜0.05，E 組 P ＜0.05，F(xiàn)組 P ＜0.05，G 組 P ＜0.01，H組 P＜0.01)。

3.3 葛根芩連湯及其拆方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中VIP的影響

表1顯示，與A組(正常組)比較，B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織中 VIP的含量均明顯高于 A組;與 B組(模型組)比較，C組、D組、E組、F組、G組、H組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織中 VIP的含量顯著降低(C組 P＜0.01，D組 P＜0.05，E 組 P ＜0.05，F(xiàn)組 P ＜0.05，G 組 P ＜0.01，H組 P＜0.01)。

4 討論

胃動(dòng)素(MTL)是由十二指腸黏膜分泌、由22個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。作為消化道運(yùn)動(dòng)激素，MTL直接作用于消化道平滑肌的細(xì)胞受體，MTL可引起胃和上部小腸產(chǎn)生消化間期綜合肌電Ⅲ相，誘發(fā)強(qiáng)力收縮和小腸明顯的分節(jié)運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)周期性發(fā)生，每次持續(xù)約25 min，并向小腸遠(yuǎn)端傳播，從而縮短小腸傳遞時(shí)間，并將胃腸內(nèi)殘?jiān)?、脫落的?xì)胞碎片和細(xì)菌等清除干凈，起著“清道夫”的作用。MTL可引起十二指腸、回腸、結(jié)腸的收縮運(yùn)動(dòng)，使結(jié)腸的壓力和電活動(dòng)增強(qiáng)。胃動(dòng)素的水平受進(jìn)餐和進(jìn)餐種類以及胃腸道消化過程和消化期間胃容量的擴(kuò)大，小腸活動(dòng)狀態(tài)和十二指腸內(nèi)酸度等其他消化道激素的影響。UC病理狀態(tài)下MTL升高可能由于結(jié)腸黏膜炎癥作用使下消化道蠕動(dòng)增快，機(jī)體為調(diào)節(jié)內(nèi)外平衡，胃小腸以適應(yīng)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，故MTL分泌和釋放增加［4］。

表1 各組UC大鼠MTL和VIP的含量(珋x±s)

血管活性腸肽(Vasoactiveintestinalpeptide，VIP)由said51等［5］于1970年從豬小腸中分離出來的一種由28個(gè)氨基酸組成的直鏈肽，屬胰高血糖素、胰泌素家族。在生物體內(nèi)，它既作為胃腸道激素，又是神經(jīng)肽。VIP能促進(jìn)胰腺的水分及碳酸氫鹽分泌，有利于胃腸黏膜黏液屏障的形成和修復(fù)，并可刺激腸液的分泌，抑制胃酸及胃泌素分泌，從而降低消化性潰瘍的發(fā)生率，促進(jìn)潰瘍的修復(fù)。VIP與胃腸運(yùn)動(dòng)主要抑制性介質(zhì)之一的NO關(guān)系密切。VIP能促進(jìn)NO合成引起環(huán)行肌舒張，NO則能使VIP易于釋放。VIP不僅可抑制胃腸的運(yùn)動(dòng)，而且可降低胃腸的緊張。最近有研究揭示，VIP是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間相互作用的一種信號(hào)分子，在局部黏膜炎癥時(shí)可促進(jìn)VIP的產(chǎn)生［5］。

綜合分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，病理組大鼠結(jié)腸組織中MTL、VIP均明顯高于其他各組。其中C組(葛根芩連湯全方組)、G組(葛根芩連湯去黃芩組)、H組(葛根芩連湯去甘草組)對(duì)大鼠結(jié)腸組織中 MTL、VIP的影響最明顯，與C組(葛根芩連湯全方組)對(duì)大鼠結(jié)腸組織中 MTL、VIP的影響比較，E組(葛根芩連湯去黃連組)、F組(葛根芩連湯去葛根和黃連組)對(duì)大鼠結(jié)腸組織中MTL、VIP的影響不明顯?，F(xiàn)代藥理研究表明，在降低腸道推進(jìn)率和減少UC大鼠炎性指數(shù)的影響中，以黃連和葛根作用為主，黃芩能拮抗黃連的作用，炙甘草與黃芩黃連配伍后能增強(qiáng)黃連的作用［6，7］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)對(duì) UC大鼠結(jié)腸組織中MTL、VIP影響最明顯的藥組是葛根、黃連、炙甘草的組合。葛根芩連湯對(duì)UC大鼠MTL的影響可能是通過對(duì)結(jié)腸黏膜炎癥的修復(fù)使消化道蠕動(dòng)減緩，胃小腸為適應(yīng)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，隨之減少 MTL分泌和釋放;葛根芩連湯通過修復(fù)UC大鼠結(jié)腸組織中結(jié)腸黏膜炎癥，使結(jié)腸黏膜炎癥減少，VIP的分泌隨之減少。

中醫(yī)認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎是以胃腸氣機(jī)阻滯、濕熱濁邪堆積為主的泄瀉，臨床以恢復(fù)胃腸運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)濁邪排除為治療目的。葛根芩連湯方中的君藥葛根輸肌以散，調(diào)暢氣機(jī)，緩解腹痛，并促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)以排泄糟粕;黃連祛除濕熱之邪，以解除壅滯于腸道的濁邪，緩解腸道阻力亦促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng);黃芩以祛除肝膽濕熱為主，此處以去除筋膜阻滯，促進(jìn)胃腸筋膜組織運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而協(xié)助胃腸運(yùn)動(dòng);甘草補(bǔ)益中氣，為腸道的運(yùn)動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，又和調(diào)諸藥。全方中君、臣藥物的配伍作用尤為突出，在方中占重要地位。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)葛根、黃連、炙甘草的組合能夠很好地恢復(fù)胃腸運(yùn)動(dòng)，清除病理產(chǎn)物和結(jié)腸組織炎癥，促進(jìn)濁邪排除。這3味藥主要?dú)w脾胃經(jīng)，而“脾主肌肉”，故葛根、黃連、炙甘草的組合以及以此為主組成的葛根芩連湯可能是通過作用于結(jié)腸肌層，調(diào)節(jié)MTL、VIP的分泌，進(jìn)而修復(fù)結(jié)腸黏膜，恢復(fù)胃腸動(dòng)力，以治療潰瘍性結(jié)腸炎。

［1］ 鄭 禮，高振強(qiáng)，王淑仙.大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1998，14(4):370-372.

［2］ Zheng L，Gao ZQ，Wang SX.A chronic ulcerative colitis model inrats.World J Gastroenterol，2000，6:150.

［3］ 王 皓，歐陽欽，胡仁偉.三硝基苯磺酸結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立［J］.胃腸病學(xué)，2001，6(1):7.

［4］ 黃裕新，許才級(jí)，馮英明，等.胃動(dòng)素在人體13種體液中含量分析［J］.中華消化雜志，1994，14(2):96-95.

［5］ Said SI，Mutt V polypeptide with broad activity:isolation from small intesti Seienee，1970;169(951):1217-8.

［6］ 王 磊，譚曉梅，王 莉，等.葛根芩連湯中黃連不同配伍對(duì)G6PD缺陷的痢疾桿菌感染大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的影響［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(2):1-2.

［7］ 羅佳波，譚曉梅，余林中，等.葛根芩連湯配伍規(guī)律的研究［J］.中草藥，2005，36(4):512-518.