殼聚糖-堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子載體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化

段紅梅,楊朝陽(yáng),李曉光

以往的觀點(diǎn)認(rèn)為,干細(xì)胞只能向其來源方向的細(xì)胞衍生。這一觀點(diǎn)嚴(yán)重限制了干細(xì)胞的應(yīng)用。近年的研究成果證實(shí),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)在體外誘導(dǎo)可以向3個(gè)胚層的細(xì)胞分化[1-5]。為此,研究者采用二甲基亞砜(DMSO)、叔丁對(duì)甲氧酚(BHA)、β-巰基乙醇等各種誘導(dǎo)劑,單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用來促使 MSCs的分化[6-7]。近幾年,在誘導(dǎo)過程中添加各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子引起人們的關(guān)注。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)是其中的一種。研究證明,bFGF可以調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的更新和分化,在應(yīng)用bFGF 1 d后就可以起始分化[8]。本實(shí)驗(yàn)主要探索MSCs經(jīng)殼聚糖-bFGF載體的誘導(dǎo)后定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能及誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞,并通過神經(jīng)細(xì)胞的特征標(biāo)記物和神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)來驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 出生7 d的Wistar乳鼠由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑：α-M EM培養(yǎng)基(Applichem)、Nestin 小鼠單克隆抗體(Chemicon,CA)、βtubulinⅢ兔單克隆抗體(Chemicon,CA)和MAP-2鼠單克隆抗體(Chemicon,CA)。

1.2 MSCs的分離培養(yǎng) 無菌冰凍麻醉?xiàng)l件下取出生7 d的Wistar大鼠股骨和脛骨,去掉骨表面的肌肉筋膜,用PBS(0.01 mol/L)將骨沖洗干凈。將骨放入含15%胎牛血清(FBS)的α-M EM培養(yǎng)基中,用小剪刀將骨髓鉗出,再將股骨端骨松質(zhì)剪掉一部分,在膝關(guān)節(jié)端用5號(hào)針頭插孔,2 ml無菌注射器徹底沖洗骨髓腔;再用5號(hào)針頭注射器反復(fù)沖打骨髓細(xì)胞,使之成為單細(xì)胞懸液,將骨髓細(xì)胞懸液以1∶1比例,輕輕順離心管壁加在淋巴細(xì)胞分離液之上,1000 r/min,離心10 min分離單個(gè)核細(xì)胞。去掉頂層脂肪,吸取細(xì)胞膜層上部分,用含15%FBS的α-MEM培養(yǎng)基洗滌2次,1000 r/min,離心 10 min。沉淀細(xì)胞用含 15%FBS的α-MEM培養(yǎng)基充分分散細(xì)胞,計(jì)數(shù)。接種(1～3)×107/10 ml培養(yǎng)液含15%FBS的α-M EM培養(yǎng)基,90 mm塑料培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h后全量換液,以后每3天全量換液1次,以去掉造血細(xì)胞干擾。連續(xù)培養(yǎng)7 d后,當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿80%時(shí),用0.25%胰酶消化基質(zhì)細(xì)胞,按1∶2傳代培養(yǎng),直至進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,可以規(guī)則傳代。

1.3 MSCs的鑒定 MSCs在連續(xù)培養(yǎng)到3～6代后對(duì)其進(jìn)行鑒定。用0.25%胰酶將貼壁的MSCs從塑料皿底部消化下來,4℃1000 r/min離心5 min,棄上清,然后用PBS洗2遍,4℃1000 r/min離心5 min棄上清,離心管底部留200μl的液體分別加入：PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD45單克隆抗體(BD Pharmingen)、FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD90單克隆抗體(BD Pharmingen)一抗;FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD44單克隆抗體(BD Pharmingen),PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗大鼠的CD45單克隆抗體(BD Pharmingen)一抗;30 min后流式細(xì)胞儀(COUL TER EPICS@XL,Amercia)檢測(cè)。

1.4 MSCs的誘導(dǎo)分化 將第3代MSCs的細(xì)胞培養(yǎng)于鋪有蓋玻片的6孔板內(nèi),分別加入不同的誘導(dǎo)劑,實(shí)驗(yàn)組1：?jiǎn)渭儦ぞ厶?4 mg/ml);實(shí)驗(yàn)組2：?jiǎn)渭?b FGF(25 ng/ml);實(shí)驗(yàn)組3：殼聚糖-b FGF載體(4 mg/ml);對(duì)照組：只加培養(yǎng)基(5 mlα-MEM培養(yǎng)基),培養(yǎng)于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,每3天半量換液1次,連續(xù)培養(yǎng)。

1.5 免疫組化染色 以上各組的細(xì)胞在誘導(dǎo)后9 d、14 d、21 d,吸出培養(yǎng)基 ,PBS(0.01 mol/L)洗 3 次 ,每次5 min;4%多聚甲醛,4℃固定40 min,PBS洗3次,每次 5 min;0.3%PBST浸泡 5 min,1%羊血清(0.3%PBST配制)封閉30 min;入一抗：Nestin(1∶100),β-tubulinⅢ(1∶100),37℃,孵育90 min,PBS漂洗同上,入熒光二抗(1∶100)避光,37℃,孵育60 min,PBS洗 3次,每次 5 min,Hochest：染核(1∶100),30 min,去離子水漂洗3次,每次5 min,封片。

MSCs誘導(dǎo)14 d后,吸出培養(yǎng)基,0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min;4%多聚甲醛,4℃固定40 min;PBS洗3次,每次5 min;3%雙氧水,室溫避光10 min;0.3%PBST洗 3次,每次 5 min;1%羊血清(0.3%PBST配制)封閉20 min;入MAP-2一抗(1∶800),37℃,孵育60 min;PBST洗 3次,每次 5 min;二抗(1∶300),37 ℃,孵育40 min;PBST洗3次,每次5 min;三抗(1∶300),37 ℃,孵育40 min;PBST洗3次,每次5 min;DAB呈色,相差顯微鏡(IX71 Olympus,Tokyo,Japan)觀察。

1.6 Western blot 分別收集殼聚糖-b FGF載體誘導(dǎo)后 7 d、9 d、14 d、21 d 的細(xì)胞 ,4℃,12000 r/min 離心15 min,加入細(xì)胞裂解液,冰上裂解 30 min;4℃,12000 r/min離心15 min,取上清,BCA法蛋白定量,并制成蛋白含量為4.0 g/L的電泳樣品,取5μl(20μg總蛋白)用8%SDS-PA GE進(jìn)行電泳,聚集膠：80 V,50 min;分離膠：100 V,90 min。電泳結(jié)束后,進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜：孔徑0.22μm的硝酸纖維素膜(NC),4℃,電流200 mA,150 min。Western blot雜交步驟：10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h,TTBS(20 mmol/L Tris-HCl,p H7.5;0.15 mmol/L NaCl;0.05%Tween20)漂洗3次,每次10 min,與MAP-2一抗(1∶1000)雜交反應(yīng)3 h,TTBS漂洗同上,再將NC膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠二抗(1∶4000)雜交反應(yīng)1 h,之后用 TTBS漂洗 NC膜3次,每次10 min,加入 ECL試劑吹打3 min,保鮮膜包裹,暗室進(jìn)行 X-光膠片曝光、顯影和定影。

1.7 細(xì)胞活性的檢測(cè) 用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide,SIGMA)比色法檢測(cè)細(xì)胞活性。96孔板中每個(gè)孔內(nèi)加入200μl細(xì)胞懸液,接種細(xì)胞數(shù)為104個(gè);實(shí)驗(yàn)分組：?jiǎn)渭儦ぞ厶墙M(4 mg/ml)、單純 bFGF組(25 ng/ml)、殼聚糖-bFGF載體組(4 mg/ml)和單純培養(yǎng)基組。每組6個(gè)重復(fù)樣本,細(xì)胞每3天半量換液1次。細(xì)胞在誘導(dǎo)1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d 后 ,每孔加入20μl的0.1 M M TT(無血清培養(yǎng)基配制,p H 7.2),孵育 4 h后,吸干上清,每孔內(nèi)加入 160μl的DMSO振蕩10 min,酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)吸光值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 X-光膠片的結(jié)果應(yīng)用 Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描后,用Quantity One分析軟件進(jìn)行定量分析;所有的數(shù)據(jù)資料以(ˉx±s)表示,統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 MSCs鑒定 典型的MSCs呈扁平形、梭形、三角形細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞接近鋪滿時(shí)呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣(圖1)。流式結(jié)果顯示,97%以上的細(xì)胞為CD44+/CD45-、CD90+/CD45-,證明從股骨和脛骨的髓腔內(nèi)提取的細(xì)胞在傳3～6代后90%以上的細(xì)胞為MSCs。見圖2～圖3。

2.2 免疫組化染色 MSCs在殼聚糖-bFGF載體誘導(dǎo)9 d和14 d后表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物β-tubulin Ⅲ(圖6、圖9);單純殼聚糖組(圖4、圖7)和單純 bFGF組(圖5、圖8)僅少量細(xì)胞表達(dá)β-tubulinⅢ和Nestin;MSCs在殼聚糖-b FGF載體誘導(dǎo)14 d后83.54%細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物βtubulin Ⅲ(圖 9)。

MSCs在誘導(dǎo)14 d后,免疫組化染色觀察到：殼聚糖-b FGF載體組有大量 MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞(圖 10、圖11),單純殼聚糖組(圖12),單純 bFGF組(圖13)僅有少量陽(yáng)性細(xì)胞。表明MSCs誘導(dǎo)14 d后,可以分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞,且形成神經(jīng)細(xì)胞的比例明顯高于單純殼聚糖組和單純bFGF組。

2.3 細(xì)胞活性的檢測(cè) 細(xì)胞活性通過M TT比色法測(cè)定,誘導(dǎo)1 d后在細(xì)胞活性方面3組無顯著性差異(P＞0.05)。誘導(dǎo) 3 d、7 d、14 d、21 d后殼聚糖-bFGF組細(xì)胞活性明顯高于單純殼聚糖組和單純b FGF組,誘導(dǎo)3 d、7 d后單純b FGF組細(xì)胞活性明顯高于單純殼聚糖組(P＜0.01)。誘導(dǎo)28 d后3組細(xì)胞活性無顯著性差異(P＞0.05)。見圖14。

2.4 Western blot MSCs經(jīng)殼聚糖-bFGF誘導(dǎo)后7 d有少量表達(dá)MAP-2,隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)MAP-2的表達(dá)量逐漸升高,且在14 d后達(dá)到穩(wěn)定(圖15、圖16)。

3 討論

近幾年很多研究都把目光集中在一些因子對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化作用上,這些因子包括介質(zhì)中彌散因子[8-9]和參與細(xì)胞間相互作用的因子[10-11]。它們可以增強(qiáng)或抑制干細(xì)胞的增殖和分化。例如：一直都認(rèn)為bFGF是神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖和分化的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12],并且可以促進(jìn)MSCs和間充質(zhì)祖細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[13]。研究表明,在缺乏b FGF的小鼠中觀察到存在神經(jīng)缺陷。這一結(jié)果證實(shí),bFGF在神經(jīng)發(fā)生中具有十分重要的作用[14]。

在本實(shí)驗(yàn)中,殼聚糖-bFGF載體可以定向誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化,且誘導(dǎo)比例明顯高于單純bFGF組和單純殼聚糖組。其中單純殼聚糖組分化的比例最低。產(chǎn)生這一現(xiàn)象主要原因?yàn)椋篵FGF加入培養(yǎng)基中很快失去活性,此時(shí)被誘導(dǎo)的細(xì)胞不能得到持續(xù)的b FGF的作用;殼聚糖-b FGF載體對(duì)b FGF具有緩釋作用,能夠長(zhǎng)時(shí)間緩慢釋放bFGF[15],保證bFGF在培養(yǎng)基中持續(xù)發(fā)揮作用,使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保持在穩(wěn)定而持續(xù)的誘導(dǎo)狀態(tài)中,提高被誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的比例,殼聚糖-b FGF載體對(duì)b FGF的緩釋作用,在保證高效率誘導(dǎo)的同時(shí)又減少bFGF因子的浪費(fèi)。

細(xì)胞黏附分子CD44、CD90是MSCs的表面標(biāo)志性抗原,白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45是造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志性抗原之一。因此,CD44+/CD45-、CD90+/CD45-細(xì)胞被認(rèn)為是骨髓間充質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)的流式結(jié)果顯示,97%以上的細(xì)胞為CD44+/CD45-、CD90+/CD45-,證明從股骨和脛骨的髓腔內(nèi)提取的細(xì)胞在傳3～6代后90%以上的細(xì)胞為MSCs。為了驗(yàn)證殼聚糖-b FGF載體可以使MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化染色間接分析各時(shí)間點(diǎn)分化細(xì)胞的表型。β-tubulinⅢ和MAP-2是成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記,Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記。形態(tài)學(xué)和分子水平上的結(jié)果均顯示,MSCs經(jīng)殼聚糖-bFGF載體誘導(dǎo)后表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物,且在誘導(dǎo)14 d后大量表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物MAP-2。證明殼聚糖-bFGF載體可以誘導(dǎo)MSCs形成成熟神經(jīng)細(xì)胞。

M TT是定量測(cè)定細(xì)胞活性的一種實(shí)驗(yàn)方法,也是當(dāng)前檢測(cè)生物材料的生物相容性和細(xì)胞毒性的主要方法[16]。本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖和MSCs共培養(yǎng),目的是為了研究殼聚糖載體是否對(duì)干細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)作用。從M TT的結(jié)果可以看出,單純殼聚糖對(duì)干細(xì)胞無細(xì)胞毒性,不會(huì)抑制干細(xì)胞的分化;單純殼聚糖組和殼聚糖-b FGF載體組在誘導(dǎo)28 d后細(xì)胞活性并無顯著性差異(P＞0.05)。

本實(shí)驗(yàn)得出,應(yīng)用殼聚糖-bFGF載體可以誘導(dǎo)MSCs高比例向類神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞分化(83.54%)。關(guān)于誘導(dǎo)形成神經(jīng)細(xì)胞是興奮性還是抑制性,誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞是否有功能,及其誘導(dǎo)分化的機(jī)制等問題,仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探索。

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