HIV-1 p24 DNA和P24蛋白聯(lián)合免疫小鼠的效果

王清濤，陳玉海，高詩(shī)娟，姜威，宋麗萍，黃文林,2

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州 510060

自1981年發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來(lái)，全球已有超過6 000萬(wàn)人感染艾滋病毒 (HIV-1)，超過一半的感染者因艾滋病以及相關(guān)疾病死亡，這種情況在發(fā)展中國(guó)家尤為嚴(yán)重[1-3]。由此可見艾滋病的傳播和流行已經(jīng)對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大的威脅，對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的危害。研發(fā)安全、有效的HIV-1疫苗是控制艾滋病在全世界范圍內(nèi)傳播的最為有效的方法，但迄今為止HIV-1疫苗的研制依然沒有成功[4]。

傳統(tǒng)的疫苗包括減毒疫苗、滅活疫苗、蛋白亞單位疫苗等，這些方法在眾多抗病毒疫苗中取得了巨大的成功，但是在 HIV-1疫苗的研究中，卻各自存在缺陷。減毒 HIV-1疫苗能夠在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中誘導(dǎo)抗病毒免疫反應(yīng)，但是其安全性問題限制了它在人類中的應(yīng)用[5]；滅活疫苗和蛋白亞單位疫苗卻無(wú)法誘導(dǎo)出有效的中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)。病毒載體疫苗和 DNA載體疫苗作為新型的疫苗策略，在HIV-1疫苗的研發(fā)中具有巨大的潛力。HIV-1病毒載體疫苗雖然能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，但是同樣存在安全性的問題[6]，而DNA載體具有安全性好、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。1992年在冷泉港舉行的疫苗大會(huì)上 DNA載體首次被報(bào)道可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病原體和腫瘤抗原的免疫反應(yīng)[7]。隨后的30年，DNA載體被越來(lái)越多地用于各種腫瘤和病原體的疫苗研究[8-9]，其中包括 HIV-1 DNA疫苗研究，這些研究證明DNA疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異的細(xì)胞免疫、體液免疫反應(yīng)和免疫記憶[6,10-12]，是一種潛力巨大的艾滋病疫苗。特別是近年來(lái)的研究：HIV-1 DNA疫苗被證明單獨(dú)使用或者與其他疫苗聯(lián)合使用能夠在靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)，HIV-1 DNA疫苗的臨床I期試驗(yàn)證明了其安全性[7]，近期 4個(gè)獸用 DNA疫苗(馬、狗、豬和魚) 被批準(zhǔn)上市[13]，這些研究進(jìn)一步表明了HIV-1 DNA疫苗的巨大潛力。但是與其他類型的HIV-1疫苗相比，DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相對(duì)較弱，人們采用了不同的策略增強(qiáng)其免疫反應(yīng)，包括抗原基因密碼子優(yōu)化，DNA載體結(jié)構(gòu)的改造與優(yōu)化，新型免疫佐劑的開發(fā)，prime-boost免疫策略，以及更為有效的疫苗遞送系統(tǒng)，這些方法都在一定程度上增強(qiáng)了DNA疫苗的免疫效果。本實(shí)驗(yàn)利用的pVAX1 DNA是載體結(jié)構(gòu)已經(jīng)進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化，并被美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì) (FDA) 批準(zhǔn)的唯一可以應(yīng)用于人體實(shí)驗(yàn)的載體DNA；本實(shí)驗(yàn)選用序列保守的核心蛋白P24作為抗原基因，構(gòu)建有望誘導(dǎo)具有交叉免疫反應(yīng)的 HIV-1疫苗[6]，并對(duì) p24基因做了密碼子優(yōu)化，以提高抗原基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pVAX1-p24 重組DNA能夠在BALB/c 小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其單獨(dú)免疫和與P24 蛋白的聯(lián)合免疫所誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)展現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。該結(jié)果提供了一種具有潛力的候選疫苗并為艾滋病疫苗的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞

pVAX1 質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司；pVAX1-luc，pShuttle-gag，pGEX-p24質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；大腸桿菌TOP10和Rosetta購(gòu)自中國(guó)TIANGEN生物科技有限公司；人轉(zhuǎn)化腎上皮細(xì)胞系 293T購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 主要試劑和材料

限制性內(nèi)切酶和連接酶購(gòu)自 TaKaRa公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；質(zhì)粒提取試劑盒和TRNzol Total RNA Reagent購(gòu)自中國(guó)TIANGEN生物科技有限公司；抗HIV-1 p24單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自中杉金橋公司。

1.3 疫苗的制備和驗(yàn)證

1.3.1 pVAX1-p24 DNA疫苗的構(gòu)建

以含有本實(shí)驗(yàn)室密碼子優(yōu)化的 gag基因的pshuttle-gag為模板，上游引物為 5′-ATGCGGCCG CCCCATCGTGCAGAACATCCA-3′ (Not I)，下游引物為 5′-GCTCTAGATTACAGCACTCTGGCCTTGT GG-3′ (XbaⅠ)，PCR 擴(kuò)增p24基因序列，產(chǎn)物經(jīng)NotⅠ和XbaⅠ酶切并回收后，與經(jīng)過相同酶酶切回收的pVAX1連接，得到的重組質(zhì)粒經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pVAX1-p24。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL氨芐和 100 mg/L氯霉素的 Dulbecco’s Medified Eagle Medium (DMEM) 培養(yǎng)基 (37 ℃，5% CO2) 中貼壁生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞按 5×105/孔接種于6孔板的孔中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%~90%時(shí)，將培養(yǎng)基換為DMEM 無(wú)血清培養(yǎng)基，隨后轉(zhuǎn)染pVAX1 質(zhì)粒和pVAX1-p24質(zhì)粒，每孔轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的量均為0.4 μg，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4~6 h，之后用含10% 血清的DMEM 培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。

1.3.3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染 pVAX1 質(zhì)粒和 pVAX1-p24質(zhì)粒的293T 細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用Bradford法測(cè)量蛋白濃度，各取 40 μg蛋白進(jìn)行 12%的SDS-PAGE凝膠電泳，然后在冰上300 mA條件下轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一定稀釋比例的一抗4 ℃反應(yīng)過夜，用TBST洗滌3次，再加連接有辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育1 h，然后用凝膠成像儀檢測(cè)。

1.3.4 P24 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒 pGEX-p24轉(zhuǎn)化 Rosetta 菌株，用IPTG 誘導(dǎo)28 ℃表達(dá)，超聲破碎提取融合P24蛋白，并經(jīng)過親和層析和蛋白酶酶切純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，最終獲得純化的P24 蛋白。

1.4 質(zhì)粒pVAX1-luc注射小鼠

6~8周齡 BALB/c雌性小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁殖中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。將 20 μg的pVAX1-luc或者pVAX1分別注射BALB/c小鼠腿部肌肉。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè) 4只小鼠，左右腿各注射1次。

1.5 活體動(dòng)物成像

pVAX1-luc或pVAX1分別注射的BALB/c小鼠7 d之后，腹腔注射100 μL終濃度30 mg/mL的D-熒光素鉀鹽。10 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉，將小鼠麻痹，通過活體動(dòng)物成像儀檢測(cè)熒光素酶在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。

1.6 肌肉組織中熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

pVAX1-luc或pVAX1注射的BALB/c 小鼠7 d之后，頸椎脫臼處死小鼠，取出腿部肌肉組織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌。在液氮中將組織研碎，用熒光素酶裂解緩沖液 (Promega，E1500型號(hào)) 在冰浴中研磨裂解細(xì)胞，裂解液在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，取上清進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。每組3只小鼠。

1.7 動(dòng)物免疫

BALB/c 小鼠隨機(jī)分成A、B和C三個(gè)小組，每組10只小鼠。A組注射pVAX1作為對(duì)照，B組注射pVAX1-p24質(zhì)粒，C組是pVAX1-p24質(zhì)粒和P24 蛋白 (添加不完全Freund 佐劑) 聯(lián)合免疫。各組注射體積均為100 μL，均采用腿部肌肉注射，左右腿各50 μL。其中pVAX1和pVAX1-p24免疫劑量是40 μg/只，P24蛋白免疫劑量是10 μg/只。第2次和第3次免疫后2周每組小鼠隨機(jī)取出5只眼眶取血，并處死取脾細(xì)胞檢測(cè)P24特異的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。動(dòng)物分組情況及免疫程序見表1。

1.8 ELISA檢測(cè)P24特異的體液免疫反應(yīng)

用表達(dá)純化的P24抗原蛋白以0.1 μg/mL的濃度包被酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜，PBST洗3次。小鼠血清以1∶100稀釋，之后倍比稀釋，每孔加樣100 μL，37 ℃孵育1 h。PBST 洗3次，加入1∶10 000稀釋的相應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入TMB顯色并讀數(shù)。

表1 動(dòng)物分組和免疫程序Table 1 Animal groups and immunization schedules

1.9 IFN-γ ELISPOT檢測(cè)P24特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)

ELISPOT平板每孔加人 100 μL IFN-γ包被抗體，4 ℃包被過夜，PBS 200 μL/孔洗滌5次，加入封閉液200 μL/孔，室溫封閉2 h，棄去封閉液，將分離的小鼠脾細(xì)胞按 1×105/孔加入 ELISPOT 96孔板，實(shí)驗(yàn)孔加入刺激物 (P24的肽庫(kù)終濃度均為10 μg/mL)，37 ℃、5% CO2孵育24 h，甩掉細(xì)胞，去離子水洗 2次，磷酸鹽吐溫緩沖液 (PBST) 洗 3次。用含10%胎牛血清的PBS 按1∶100稀釋HRP，100 μL/孔溶液加入ELISPOT板中，室溫下孵育1 h。棄掉液體，拍干PBST洗滌4次后用PBS洗滌2次。加入顯色底物100 μL/孔，室溫下避光放置5~20 min (并肉眼觀察顏色變化)，100 μL/孔去離子水終止顯色，用去離子水200 μL/孔洗滌后晾干，用CTL公司Immunospot讀數(shù)儀讀數(shù)，分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒 pVAX1-p24 DNA疫苗的構(gòu)建與表達(dá)

重組質(zhì)粒pVAX1-p24的啟動(dòng)子為Pcmv，抗性為Kanamycin，復(fù)制子為pUC ori，所攜帶的抗原基因是HIV-1的衣殼蛋白p24基因。將pVAX1-p24質(zhì)粒和pVAX1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h之后，裂解細(xì)胞收集上清液并用Western blotting技術(shù)檢測(cè)P24蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖 1所示，pVAX1-p24 DNA能夠在293T細(xì)胞中高效表達(dá)P24蛋白。

2.2 HIV-1 P24重組蛋白的表達(dá)純化和鑒定

將融合表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-p24轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌，用 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。親和層析酶切純化后的表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，在相對(duì)分子量約24 kDa的位置有一條明顯的條帶，大小與p24蛋白一致。

圖1 pVAX1-p24 DNA在293T細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 1 Expression of pVAX1-p24 in 293T cells by Western blotting. 1: 293T cells transfected with pVAX1; 2: 293T cells transfected with pVAX1-p24.

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)純化的P24蛋白Fig. 2 Purified P24 protein by SDS-PAGE. 1: P24 protein; 2: protein marker; 3: negative control.

2.3 pVAX1-luc DNA在小鼠腿部肌肉中的表達(dá)

DNA 疫苗免疫效果的一個(gè)限制因素是抗原能否在機(jī)體內(nèi)有效地表達(dá)[14-15]，為了驗(yàn)證pVAX1 DNA攜帶的抗原基因在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)情況，我們構(gòu)建了攜帶 luciferase 基因的 pVAX1，命名為 pVAX1-luc DNA。在小鼠腿部肌肉分別注射pVAX1-luc DNA和pVAX1 DNA，7 d后使用活體動(dòng)物成像技術(shù)和肌肉組織中熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)報(bào)告基因在肌肉組織中的表達(dá)情況。如圖 3所示，肌肉注射之后外源基因能夠在小鼠腿部肌肉位置有效表達(dá)。

圖3 pVAX1-luc DNA肌肉注射后在小鼠體內(nèi)的表達(dá)Fig. 3 Luciferase expression in mice muscle after seven days detected by in vivo imaging system (A) and by luciferase assay system (B).

2.4 ELISA檢測(cè)pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫和聯(lián)合P24蛋白免疫誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)

pVAX1-p24 DNA 疫苗以 40 μg/只的劑量免疫BALB/c小鼠，并在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周檢測(cè)P24特異的體液免疫反應(yīng)水平。如圖4所示，pVAX1-p24 DNA疫苗能夠在BALB/c小鼠模型中誘導(dǎo)出明顯的體液免疫反應(yīng)，3次免疫后的體液免疫反應(yīng)比2次免疫后體液免疫水平提高2.9倍。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還采取了pVAX1-p24 DNA聯(lián)合P24蛋白的免疫策略。結(jié)果顯示第2次免疫后2周聯(lián)合免疫顯示出了強(qiáng)的免疫效果，其誘導(dǎo)的特異抗體滴度是pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫誘導(dǎo)的抗體滴度的 7.3倍，說明DNA疫苗和蛋白聯(lián)合免疫能夠誘導(dǎo)出更強(qiáng)的抗原特異的體液免疫反應(yīng)。第3次免疫后2周，各組之間的抗體反應(yīng)水平趨勢(shì)和第2次免疫之后相同，但是聯(lián)合免疫與 DNA單獨(dú)免疫組間的差異更加明顯，聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的特異抗體滴度是 DNA單獨(dú)免疫誘導(dǎo)的抗體滴度的8倍。說明與DNA疫苗單獨(dú)免疫相比，DNA疫苗和蛋白聯(lián)合免疫能夠誘導(dǎo)出更強(qiáng)的抗原特異的體液免疫反應(yīng)。

圖4 pVAX1-p24單獨(dú)免疫和聯(lián)合P24蛋白免疫BALB/c誘導(dǎo)的P24特異體液免疫反應(yīng)Fig. 4 p24-specific humoral immune responses in BALB/c mice immunized with pVAX1-p24 DNA prime and boost or pVAX1-p24 DNA prime protein boost.

2.5 IFN-γ ELISPOT檢測(cè)pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫和聯(lián)合P24蛋白免疫誘導(dǎo)的P24特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)

IFN-γ ELISPOT檢測(cè)結(jié)果表明pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫與聯(lián)合免疫均可誘導(dǎo)出有效的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。但與體液免疫反應(yīng)不同，單獨(dú)免疫則表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞免疫誘導(dǎo)特性，第2次免疫后2周，pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫所誘導(dǎo)的P24特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平是聯(lián)合免疫組的2.3倍。第 3次免疫后2周，特異性細(xì)胞免疫水平和第2次免疫后趨勢(shì)相同，但是差異更加明顯，pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫組是聯(lián)合免疫組的 5.5倍。進(jìn)一步說明了不同的免疫方式將產(chǎn)生不同的免疫效果。

圖5 pVAX1-p24 DNA單獨(dú)免疫和與P24蛋白聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的P24特異細(xì)胞免疫反應(yīng)Fig. 5 The p24-specific cellular immune responses in BALB/c mice immunized with pVAX1-p24 DNA prime and boost or pVAX1-p24 DNA prime protein boost.

3 討論

盡管作為疫苗載體，DNA疫苗有巨大的潛在優(yōu)勢(shì)，但也同時(shí)存在一些限制因素，限制DNA疫苗的免疫效果，其中一個(gè)重要的限制因素就是DNA載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率不高，被抗原呈遞細(xì)胞吸收并進(jìn)入細(xì)胞核有效表達(dá)的效率更低[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pVAX1-luc能夠在小鼠腿部肌肉的注射位置周圍有效表達(dá)，這也是pVAX1-p24 DNA疫苗能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的保證。但是動(dòng)物活體成像的結(jié)果表明其表達(dá)效率也不是很高，所以在今后的實(shí)驗(yàn)中可以通過改進(jìn)pVAX1-p24 DNA疫苗的免疫方法，提高抗原基因在機(jī)體細(xì)胞中的表達(dá)效率來(lái)進(jìn)一步提高pVAX1-p24 DNA 疫苗的免疫效果[17]。

DNA疫苗和蛋白疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體免疫方面各有特點(diǎn)，其中DNA疫苗能夠誘導(dǎo)以抗原特異的細(xì)胞免疫為主的免疫反應(yīng)[18]，而蛋白疫苗則誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以抗原特異的體液免疫反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)[19]，許多研究利用 DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫來(lái)誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[18,20-21]。但并不是所有的利用 DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫的研究都能夠誘導(dǎo)出更高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，例如Osorio等報(bào)道無(wú)論是DNA疫苗初免蛋白疫苗加強(qiáng)還是蛋白疫苗初免DNA疫苗加強(qiáng)與DNA單獨(dú)免疫相比，都沒有明顯的優(yōu)勢(shì)，反而是DNA單獨(dú)免疫組 INF-γ的水平更高[22]。Rafati等也報(bào)道了DNA免疫組與DNA和蛋白聯(lián)合免疫組相比，細(xì)胞免疫反應(yīng)水平更高[23]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明pVAX1-p24 DNA疫苗單獨(dú)免疫能夠誘導(dǎo)出更高的P24特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而pVAX1-p24和P24蛋白疫苗聯(lián)合免疫則誘導(dǎo)出更高水平的P24特異的體液免疫反應(yīng)。這可能和DNA疫苗以及蛋白疫苗各自的免疫機(jī)制有關(guān)?，F(xiàn)在關(guān)于DNA疫苗的免疫機(jī)制并不是特別清楚，但一般認(rèn)為DNA疫苗在體內(nèi)的抗原表達(dá)和抗原呈遞過程類似與病原體天然的感染過程。DNA進(jìn)入細(xì)胞之后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，隨后被胞內(nèi)的蛋白水解酶降解成短肽并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHC-Ⅰ分子形成復(fù)合物，經(jīng)MHC-Ⅰ分子途徑呈遞，激活CD8+T細(xì)胞，部分蛋白也可能分泌或釋放，經(jīng)MHC-Ⅱ分子途徑激活體液免疫反應(yīng)，所以DNA疫苗能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，但以細(xì)胞免疫反應(yīng)為主[24-25]。而蛋白疫苗進(jìn)入機(jī)體后，很難直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而是被巨噬細(xì)胞或者樹突狀細(xì)胞等專職抗原呈遞細(xì)胞吞噬，在內(nèi)吞體或者溶酶體內(nèi)被加工成為短肽并與 MHC-Ⅱ分子形成復(fù)合物，經(jīng)MHC-Ⅱ分子途徑呈遞從而誘導(dǎo) B淋巴細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生，產(chǎn)生以體液免疫反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)[24]。另外，聯(lián)合免疫組細(xì)胞免疫反應(yīng)水平比DNA單獨(dú)免疫組低也可能是由于我們所使用的 DNA載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率低和持續(xù)時(shí)間短，只免疫一次DNA無(wú)法提供強(qiáng)烈而持久的刺激，從而導(dǎo)致細(xì)胞免疫反應(yīng)水平低?？梢酝ㄟ^調(diào)整免疫策略提高聯(lián)合免疫的免疫效果，例如采用DNA-蛋白-DNA的免疫策略，提高細(xì)胞免疫反應(yīng)水平。除此之外，這可能還與免疫劑量、疫苗佐劑等因素有關(guān)。盡管本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合免疫組的細(xì)胞免疫反應(yīng)與 DNA單獨(dú)免疫組相比較弱，但它同時(shí)誘導(dǎo)出較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，這種更為全面的免疫反應(yīng)對(duì)于機(jī)體針對(duì)一些病毒的免疫保護(hù)作用可能更為重要。而對(duì)于 HIV-1，最為理想的疫苗應(yīng)該是能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的疫苗[4]。當(dāng)然，針對(duì)不同的病毒，需要不同特點(diǎn)的免疫反應(yīng)，要求采取不同的免疫策略。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果就為誘導(dǎo)不同特點(diǎn)的免疫反應(yīng)提供了理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pVAX1-p24 DNA疫苗能夠在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)明顯的P24 特異的免疫反應(yīng)。并且pVAX1-p24 DNA 單獨(dú)免疫以及聯(lián)合P24蛋白疫苗免疫誘導(dǎo)免疫反應(yīng)呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)，這一研究結(jié)果為艾滋病疫苗的研究提供了理論基礎(chǔ)和一種潛力的候選疫苗。

[1] Lu L, Jia M, Ma Y, et al. The changing face of HIV in China. Nature, 2008, 455(7213): 609?611.

[2] Weiss RA. HIV and AIDS: looking ahead. Nat Med, 2003, 9(7): 887?891.

[3] Greene WC. A history of AIDS: looking back to see ahead. Eur J Immunol, 2007, 37(Suppl 1): S94?S102.

[4] Barouch DH. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature, 2008, 455(7213): 613?619.

[5] Wyand MS, Manson KH, Garcia-Moll M, et al. Vaccine protection by a triple deletion mutant of simian immunodeficiency virus. J Virol, 1996, 70(6): 3724?3733.

[6] Priddy FH, Brown D, Kublin J, et al. Safety and immunogenicity of a replication-incompetent adenovirus type 5 HIV-1 clade B gag/pol/nef vaccine in healthy adults. Clin Infect Dis, 2008, 46(11): 1769?1781.

[7] Kutzler MA, Weiner DB. DNA vaccines: ready for prime time? Nat Rev, 2008, 9(10): 776?788.

[8] Barouch DH, Yang ZY, Kong WP, et al. A human T-cell leukemia virus type 1 regulatory element enhances the immunogenicity of human immunodeficiency virus type 1 DNA vaccines in mice and nonhuman primates. J Virol, 2005, 79(14): 8828?8834.

[9] Marsac D, Puaux AL, Riviere Y, et al. In vivo induction of cellular and humoral immune responses by hybrid DNA vectors encoding simian/human immunodeficiency virus/hepatitis B surface antigen virus particles in BALB/c and HLA-A2-transgenic mice. Immunobiology, 2005, 210(5): 305?319.

[10] Catanzaro AT, Koup RA, Roederer M, et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of a multiclade HIV-1 candidate vaccine delivered by a replication-defective recombinant adenovirus vector. J Infect Dis, 2006, 194(12): 1638?1649.

[11] Catanzaro AT, Roederer M, Koup RA, et al. Phase I clinical evaluation of a six-plasmid multiclade HIV-1 DNA candidate vaccine. Vaccine, 2007, 25(20): 4085?4092.

[12] Liu J, O'Brien KL, Lynch DM, et al. Immune control of an SIV challenge by a T-cell-based vaccine in rhesus monkeys. Nature, 2009, 457(7225): 87?91.

[13] Liu MA, Wahren B, Karlsson Hedestam GB. DNA vaccines: recent developments and future possibilities. Human Gene Ther, 2006, 17(11): 1051?61.

[14] van Drunen Littel-van den Hurk S, Hannaman D. Electroporation for DNA immunization: clinical application. Expert Rev Vaccines, 9(5): 503?517.

[15] Cemazar M, Sersa G. Electrotransfer of therapeutic molecules into tissues. Curr Opin Molecul Ther, 2007, 9(6): 554?562.

[16] Roos AK, Eriksson F, Timmons JA, et al. Skin electroporation: effects on transgene expression, DNA persistence and local tissue environment. PLoS ONE, 2009, 4(9): e7226.

[17] Paster W, Zehetner M, Kalat M, et al. In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+T-cell responses. Gene Therapy, 2003, 10(9): 717?724.

[18] Shu Y, Winfrey S, Yang ZY, et al. Efficient protein boosting after plasmid DNA or recombinant adenovirus immunization with HIV-1 vaccine constructs. Vaccine, 2007, 25(8): 1398?1408.

[19] Walker LE, Vang L, Shen X, et al. Design and preclinical development of a recombinant protein and DNA plasmid mixed format vaccine to deliver HIV-derived T-lymphocyte epitopes. Vaccine, 2009, 27(50): 7087?7095.

[20] Wang S, Kennedy JS, West K, et al. Cross-subtype antibody and cellular immune responses induced by a polyvalent DNA prime-protein boost HIV-1 vaccine in healthy human volunteers. Vaccine, 2008, 26(8): 1098?1110.

[21] Nchinda G, Amadu D, Trumpfheller C, et al. Dendritic cell targeted HIV gag protein vaccine provides help to a DNA vaccine including mobilization of protective CD8+T cells. Proc Nat Acad Sci USA, 107(9): 4281?4286.

[22] Osorio Y, Cohen J, Ghiasi H. Improved protection from primary ocular HSV-1 infection and establishment of latency using multigenic DNA vaccines. Invest Ophthalmol Visual Sci, 2004, 45(2): 506?514.

[23] Rafati S, Ghaemimanesh F, Zahedifard F. Comparison of potential protection induced by three vaccination strategies (DNA/DNA, Protein/Protein and DNA/Protein) against leishmania major infection using signal peptidase type I in BALB/c mice. Vaccine, 2006, 24(16): 3290?3297. [24] Srivastava IK, Liu MA. Gene vaccines. Ann Int Med, 2003, 138(7): 550?559.

[25] Alpar HO, Papanicolaou I, Bramwell VW. Strategies for DNA vaccine delivery. Expert Opin Drug Deliv, 2005, 2(5): 829?842.