兔多殺性巴氏桿菌的分離與PCR鑒定

苗立中 ,李 峰,王 艷,李書光,謝金文,沈志強(qiáng)

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600）

兔巴氏桿菌病(又稱兔出血性敗血癥）,是由多殺性巴氏桿菌引起的急性、致死性傳染病。兔巴氏桿菌病臨床上以出現(xiàn)鼻炎、地方流行性肺炎、全身性敗血癥、中耳炎、結(jié)膜炎、子宮積膿和睪丸炎等特征。本病發(fā)生后多呈散發(fā)性,因此難以凈化兔群,如不及時(shí)采取有效措施會(huì)引起家兔生長緩慢、飼料報(bào)酬降低或大批死亡及藥物防治費(fèi)用增加,給養(yǎng)兔業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2010年3月山東淄博某兔場養(yǎng)殖的種兔和肉兔,出現(xiàn)急性死亡,經(jīng)本院獸醫(yī)診斷中心對(duì)病死兔進(jìn)行病原分離與鑒定,證實(shí)為兔多殺性巴氏桿菌引起。

1 發(fā)病情況及病理變化

發(fā)病兔場存欄兔856只,其中成年兔532只,小兔324只。發(fā)病期間病兔156只,發(fā)病率18.2%;發(fā)病死亡83只,其中小兔26只。部分兔未發(fā)現(xiàn)任何癥狀即突然死亡。

大多數(shù)病兔表現(xiàn)精神沉郁,行動(dòng)遲緩,被毛零亂,有的食欲減弱或不食,鼻端被毛潮濕、纏結(jié),眼結(jié)膜、鼻腔黏膜充血、出血,鼻腔有黏液流出,呼吸急促、困難,用前爪抓擦外鼻孔。腹瀉,排綠色稀糞,體溫40.7℃～42.2℃,一般發(fā)病后1～3 d死亡;病程稍長的,可見病兔四肢關(guān)節(jié)腫脹,行動(dòng)不便。

剖檢死兔,可見腹膜、皮下組織有小點(diǎn)出血;喉氣管有點(diǎn)狀出血;心包膜有出血斑點(diǎn);肺呈多發(fā)性肺炎,有氣腫出血;肝臟腫大、質(zhì)脆、棕黃色,表面有出血點(diǎn);脂肪變性;脾臟、腎臟腫大、出血;胃腸道出血,小腸出血嚴(yán)重,十二指腸呈卡他性出血性腸炎,腸系膜出血;淋巴結(jié)腫大、出血。

2 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離及分子生物學(xué)診斷

2.1 材料

2.1.2 試驗(yàn)藥品 麥康凱瓊脂,購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;瓊脂粉,購自中國惠興生化試劑有限公司;馬丁肉湯培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基及生化試劑,均按常規(guī)方法制備。生化管均購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠體重18～22 g,購自山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)兔體重3.0～3.5 kg由山東綠都生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.1.4 受試菌液的制備 分離菌株純化后接種于5.0m L馬丁肉湯,37℃培養(yǎng)20 h,活菌計(jì)數(shù)后,調(diào)整菌液濃度,使其達(dá)到1×109CFU/m L作為感染試驗(yàn)用菌液。

2.2 方法

2.2.1 病料涂片鏡檢 無菌采取兔的心血、肝臟和脾臟組織,干燥固定后分別做革蘭染色和瑞氏染色,然后鏡檢觀察。

2.2.2 病原分離培養(yǎng)及純化 無菌取肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、腦組織和鼻內(nèi)分泌物分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上[2],37℃培養(yǎng)48 h,從鮮血瓊脂培養(yǎng)基挑取單個(gè)典型菌落再次接種于該培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)48 h;再次挑取單個(gè)典型菌落,將其一半接種到鮮血瓊脂斜面上進(jìn)行純培養(yǎng),同時(shí)將另一半菌落涂片、革蘭染色、鏡檢;純培養(yǎng)物置4℃冰箱中保存,備用。

2.2.3 生化試驗(yàn) 從4℃冰箱內(nèi)取出2株疑似巴氏桿菌分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物,在超凈臺(tái)內(nèi)分別挑取單菌落穿刺接種葡萄糖、蔗糖、乳糖等生化管內(nèi),相同的生化管接種 3管,用封口膜封口,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果。

2.2.4 致病性及動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取健康小鼠12只,隨機(jī)分成 3組,Zp1、Zp2為試驗(yàn)組,Zp3為對(duì)照組。3組小鼠各皮下注射相應(yīng)的菌株肉湯培養(yǎng)物0.2m L/只(1.0×109CFU/m L）,觀察小鼠死亡情況,死亡小鼠進(jìn)行剖檢,觀察組織病變;采其心血涂片、染色、鏡檢,同時(shí)采集肝臟、脾臟、肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

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家兔回歸試驗(yàn):取16只健康家兔隨機(jī)分為4組,在腿部做好標(biāo)記。兩組試驗(yàn)組家兔接種分離菌株純化物Zp1和Zp2,標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組接種Zp3株,頸部皮下,2m L/只(1.0×1010CFU/m L）;陰性對(duì)照組注射等量生理鹽水,4組家兔相同條件飼養(yǎng)。接種后48 h內(nèi)每8 h測體溫1次,并記錄。對(duì)死亡家兔進(jìn)行剖檢,取其心血涂片、染色、鏡檢,同時(shí)采集死亡兔肝臟、脾臟、肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2.2.5 藥敏試驗(yàn) 按常規(guī)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。判定標(biāo)準(zhǔn)為抑菌環(huán)直徑在15 mm以上為高度敏感(青霉素高敏為20mm以上）;10～15mm為中度敏感;10 mm以下為低度敏感;無抑菌環(huán)為不敏感。

2.2.6 PCR鑒定 上游引物 P1:5′-ATCCGCTATTYACCCAGTGG-3′。下游引物 P2:5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′。

純培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種于馬丁肉湯,37℃搖床培養(yǎng)16 h,煮沸法提取DNA。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL）:滅菌去離子水17μL,10×Bu ffer 2.5μL,10mmo l/L dNTP 2μL,10 pmol/μL 上 、下游引物各1μL,模板1μL,Taq酶(5 U/μL）0.5μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5m in、94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳,凝膠成像儀觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌涂片鏡檢 將病料涂片,分別用革蘭染色和瑞氏染色后顯微鏡下觀察,瑞氏染色的涂片可見兩極著色明顯的球桿菌,兩極之間兩側(cè)連線明顯,革蘭染色為陰性、兩端著色較深的單個(gè)或成對(duì)的球桿菌。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 將病料分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板,置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察,可見鮮血瓊脂培養(yǎng)基上菌落為圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊、淺灰色、半透明、直徑為2～3 mm,在折光檢驗(yàn)時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)綠色;麥康凱瓊脂平板無菌生長。取典型菌落涂片,經(jīng)革蘭染色及瑞氏染色后鏡檢,可見球桿菌。

3.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 見表1。

生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示,符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 Zp1株、Zp2株、Zp3株3組小鼠均在接種后48 h內(nèi)全部死亡。剖檢死亡小鼠,3株菌在接種局部均可見肌肉及皮下組織水腫和炎癥,胸腔和心包有漿液性纖維素滲出物,心外膜有多數(shù)出血點(diǎn),肝臟、淋巴結(jié)水腫增大,取肺臟、肝臟等病變組織涂片,瑞氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)兩極濃染的球桿菌;革蘭染色鏡檢為兩極濃染的陰性球桿菌,符合多殺性巴氏桿菌的形態(tài)特性。

表1 3株菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

家兔回歸試驗(yàn)兩試驗(yàn)組及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組家兔于48 h內(nèi)全部死亡,死前精神委靡,呆立不動(dòng),食欲減退,呼吸困難,體溫升高;陰性對(duì)照組家兔均健活,無任何臨床癥狀。立即剖檢死亡家兔,可見其心外膜、呼吸道黏膜、肺臟、淋巴結(jié)有出血斑點(diǎn)。用心血涂片、革蘭染色、鏡檢,顯為陰性球桿菌。

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 兩分離菌株各種藥物抑菌圈的大小基本一致,參照前述藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)可知,頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考和磺胺六甲氧嘧啶對(duì)分離菌Zp1、Zp2有較好的藥物敏感性,多西環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、新霉素中敏;青霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素低敏。

3.6 菌落PCR鑒定結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離后,通過凝膠成像系統(tǒng)顯示結(jié)果如圖1,在457 bp處有一條亮帶,為目的條帶,證明PCR擴(kuò)增成功。

圖1 菌落PCR鑒定的電泳結(jié)果

4 討論

4.1 根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)、病理變化、分離菌株形態(tài)染色鏡檢觀察、培養(yǎng)特性、生化特性、致病性試驗(yàn)、PCR鑒定等結(jié)果,可以確定所分離的菌株為兔多殺性巴氏桿菌。

4.2 從藥敏試驗(yàn)的結(jié)果來看,此兔群分離的多殺性巴氏桿菌的耐藥性較強(qiáng),14種抗生素中只有5種高敏,可能與臨床中不合理使用抗生素有關(guān)。此兔群經(jīng)頭孢噻呋、氟苯尼考等高敏藥物治療,同時(shí)采用相應(yīng)綜合防制措施,治療效果顯著,病情得到了控制。4.3 兔多殺性巴氏桿菌PCR鑒定方法,(本試驗(yàn)采取從純培養(yǎng)物中進(jìn)行檢測）,大大縮短檢測時(shí)間,能夠快速診斷疫病,對(duì)于盡快采取防制措施有重要的實(shí)踐意義。