高效液相色譜法定量測定鴕鳥油中的EPA、DPA

楊秀芳, 閆倩茹, 伍發(fā)云

(教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引 言

多不飽和脂肪酸(PUFA)是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵，碳鏈中碳原子數(shù)大于或等于18的脂肪酸、如亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(簡稱EPA)、二十二碳六烯酸(簡稱DHA)和二十二碳五烯酸(簡稱DPA)等.一般認(rèn)為多不飽和脂肪酸在人體生理中起著極為重要的作用，若膳食中攝入不足或機(jī)體代謝缺陷，將會(huì)導(dǎo)致現(xiàn)代諸多文明病.尤其是EPA、DHA、DPA被稱之為“腦黃金”， 不僅是構(gòu)成高等動(dòng)物細(xì)胞的重要成分之一，而且可降低血清膽固醇，減少心腦血管疾病[1]，對(duì)于癌細(xì)胞也有抑制作用[2].目前EPA、DHA、DPA等的唯一商業(yè)來源是海洋魚油[1]，故PUFA已成為當(dāng)前功能性脂肪酸研究與開發(fā)的主體和核心.有關(guān)鴕鳥油脂肪酸的組成在文獻(xiàn)[3]中已有報(bào)道，為進(jìn)一步探究其PUFA組成，本文應(yīng)用HPLC對(duì)所獲得的鴕鳥油進(jìn)行了分析，結(jié)果表明鴕鳥油中含EPA和DPA，這為拓寬鴕鳥油的應(yīng)用市場和提高其應(yīng)用價(jià)值提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

鴕鳥油(1號(hào)油：非洲鴕鳥油，乙醚提取的新鮮油；2號(hào)油： 非洲鴕鳥油，乙醚提取的冰凍油；3號(hào)油：澳洲鴕鳥油，即鴯鹋油，乙醚提取的新鮮油；原材料由陜西省英考鴕鳥股份有限公司提供).

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(美國Waters公司)：包括510型高壓泵、HW-2000型色譜工作站、MILI-Q超純水制備裝置、超聲波清洗器、溶劑過濾器、微孔濾膜(0.22 μm)等；HD-2004型紫外檢測儀(上海嘉鵬科技有限公司)；R502B型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司).

色譜標(biāo)準(zhǔn)品(含量不少于99%)：EPA(20∶5n-3)、DPA(22∶5n-3)、DHA(22∶6n-3)由美國 Sigma公司提供，乙腈(色譜純)，α-溴苯乙酮(連云港達(dá)瑞化工廠).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 最佳紫外波長的測定

用紫外檢測儀測定3種標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收波長，結(jié)果EPA、DPA和DHA的最佳紫外吸收波長均為252 nm.

1.3.2 色譜分析條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μL)，柱溫：室溫(25 ℃)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：252 nm，進(jìn)樣體積：20 μL，檢測器：481型紫外-可見光檢測器.

1.3.3 樣品游離脂肪酸的制備

秤取10 g干燥鴕鳥油于三口燒瓶中，加入1 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液，58 ℃水浴攪拌1 h.倒入燒杯冷卻至室溫，加入石油醚攪拌然后放入冰箱使其脂肪酸鈉鹽充分析出.用布氏漏斗抽濾使脂肪酸鈉與石油醚溶解的不皂化物分離，將脂肪酸鈉鹽用少量蒸餾水溶解，緩慢滴加10 mol/L的鹽酸，直到下層溶液的pH值為2～4，此時(shí)上層為游離脂肪酸.轉(zhuǎn)入分液漏斗，用石油醚萃取上層溶液，蒸餾水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上回收石油醚，即得樣品游離脂肪酸(FFA).

1.3.4 柱前衍生化

量取樣品游離脂肪酸溶液0.1 mL于試管中，分別加入0.2 mLα-溴代苯乙酮的丙酮溶液和0.2 mL三乙胺的丙酮溶液，振蕩混勻，氮?dú)獗Ｗo(hù)，密封試管，置于70 ℃水浴25 min，冷卻后加入0.1 mL 醋酸丙酮溶液，反應(yīng)完后用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑吹干，加入流動(dòng)相復(fù)溶至10 mL.取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以外標(biāo)法定量.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

在選定的色譜分析條件下，將3種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1，可見EPA、DHA和DPA均能得到很好的分離，同時(shí)EPA、DHA和DPA保留時(shí)間分別為13.307 min、16.651 min和21.778 min.

圖1 EPA、DHA和DPA的標(biāo)準(zhǔn)譜圖 圖2 1號(hào)鴕鳥油中EPA、DHA和DPA的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

以脂肪酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制EPA、DPA和DHA的標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸.從EPA、DPA和DHA的線性回歸方程可以看出，3種脂肪酸的濃度峰和面積的線性相關(guān)性密切，三者的線性回歸方程分別為：

EPA：Y= 6.675×105X，r= 0.999 934； DPA：Y= 6.741×105X，r= 0.999 747； DHA：Y= 4.384 ×105X，r= 0.999 947.

2.3 樣品譜圖

2.3.1 1號(hào)鴕鳥油分析結(jié)果

稱取一定量的1號(hào)鴕鳥油按1.3.3制備出FFA，將FFA配成50 mL乙腈溶液，取0.1 mL FFA乙腈溶液進(jìn)行衍生化后用HPLC測定其中EPA、DHA和DPA的含量，結(jié)果見圖2.分析后可知1號(hào)鴕鳥油衍生物中EPA和DPA含量很低，分別為0.007 2%和0.022%，其中不含有DHA.

2.3.2 2號(hào)鴕鳥油分析結(jié)果

按1.3.3稱取一定量的2號(hào)鴕鳥油制備FFA，并配成50 mL乙腈溶液，衍生化后用HPLC測定其中EPA、DHA和DPA的含量，結(jié)果見圖3，顯示2號(hào)鴕鳥油衍生物中EPA和DPA含量分別為0.003 3%和0.030%.

圖3 2號(hào)鴕鳥油中EPA、DHA和DPA的色譜圖 圖4 3號(hào)鴕鳥油中EPA、DHA和DPA的色譜圖

2.3.3 3號(hào)鴕鳥油分析結(jié)果

按1.3.3稱取一定量的3號(hào)鴕鳥油制備FFA，配成50 mL乙腈溶液，衍生化后用HPLC測定其中EPA、DHA和DPA的含量，結(jié)果如圖4所示，3號(hào)鴕鳥油衍生物中EPA和DPA的含量分別為0.004 9%和0.059%，其中不含有DHA.

3 結(jié) 論

利用HPLC測定了3種鴕鳥油中長鏈不飽和脂肪酸EPA、DPA和DHA的含量.采用α-溴苯乙酮作為衍生劑，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行柱前衍生化，在脂肪酸分子中引入具有紫外吸收的基團(tuán).檢測結(jié)果表明，在3種鴕鳥油中都檢測出EPA和DPA，但均未檢測出DHA，其中1號(hào)鴕鳥油中EPA含量為0.007 2%，DPA含量為0.022%；2號(hào)鴕鳥油中EPA含量為0.003 3%，DPA含量為0.030%；3號(hào)鴕鳥油中EPA含量為0.004 9%，DPA含量為0.059%.

參考文獻(xiàn)

[1] 徐天宇.利用生物技術(shù)生產(chǎn)二十碳五烯酸和十二碳六烯酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1995，(l):56-64.

[2] Hinton A Jr， Ingram KD. Use of oleic acid to reduce the population of bacterial flora of poultry skin[J]. J. Food Prot, 2000, 63(9): 1 282-1 286.

[3] 楊秀芳,伍發(fā)云,馬養(yǎng)民,等．鴕鳥油理化性質(zhì)及脂肪酸組成分析[J]．中國油脂，2010，35(1)：77-79．