EphA4－ephrinA3系統(tǒng)在海馬腦區(qū)缺血／再灌注中的表達(dá)變化1）

劉乃紅，王 銳，王 曄，李建國，張 策

建立短暫前腦缺血／再灌注模型，觀察海馬（EphA4－ephrinA3）的分布特點(diǎn)及在缺血／再灌注過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)元凋亡的相關(guān)檢測，以期明確EphA4在神經(jīng)元遲發(fā)性死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，體重180g～240g，隨機(jī)分為兩組。偽手術(shù)對照組，缺血／再灌注組（缺血15min，再灌注6 h、24h、48h），每組6只。

1.2 大鼠前腦缺血／再灌注模型的建立 采用改良的Pulsinelli四血管夾閉方法進(jìn)行短暫前腦缺血。行升主動(dòng)脈灌注固定以進(jìn)行TUNEL染色，麻醉后斷頭提取新鮮大腦海馬組織，并分離海馬組織的上半部，主要為CA1區(qū)，以及下半部，主要為CA3區(qū)，保存于－80℃，以進(jìn)行Caspase 3活性的測定。偽手術(shù)（sham）組先行灼閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，次日打開頸部切口但不夾閉頸動(dòng)脈造成缺血，余處理同缺血／再灌注組。

1.3 海馬組織神經(jīng)元TUNEL染色 利用In Situ Cell Death Detection試劑盒（Promega公司）進(jìn)行檢測。應(yīng)用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。計(jì)數(shù)海馬錐體神經(jīng)元中陽性細(xì)胞所占的百分比。

1.4 海馬組織Caspase 3活性分析 提取海馬組織樣品，冰浴中勻漿，離心取上清。按試劑盒說明測定蛋白濃度及Caspase－3活性。結(jié)果以比活性反應(yīng)海馬組織中Caspase－3的活性。

1.5 Western blot測定EphA4和ephrinA3的蛋白表達(dá) 利用SDS－PAGE電泳技術(shù)分離勻漿組織中的蛋白，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用 EphA4，ephrinA3單克隆抗體（Santa Cruze，Inc），免疫印跡檢測腦組織EphA4，ephrin A3含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 短暫腦缺血／再灌注對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響 至缺血／再灌注后7d，CA1區(qū)細(xì)胞帶消失，提示CA1區(qū)神經(jīng)元大量死亡。腦缺血／再灌注7d組，顯示CA1區(qū)廣泛錐體神經(jīng)元死亡，而CA3和齒狀回細(xì)胞無明顯變化。

2.2 海馬CA1區(qū)Caspase 3活性增高及神經(jīng)元凋亡增加Caspase 3活性在缺血／再灌注后6h即有升高，6h、24h、48h OD值分別為2.30±0.19，2.20±0.28，1.900±0.015，與sham組（OD值為1.100±0.017）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TUNEL檢測結(jié)果與Caspase一致（TUNEL陽性率分別為24.50±5.36，22.30±4.76，23.80±4.17）。短暫腦缺血／再灌注可以引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡增加，與sham組（5.33±3.33）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 CA1區(qū)ephrinA3與EphA4蛋白表達(dá) 與對照組相比，海馬缺血／再灌注后6h海馬CA1區(qū)組織中ephrin A3的含量顯著增高，IOD值為2.05±0.12vs 0.78±0.02（P＜0.05），隨后明顯減少，但在再灌注24h與對照相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再灌注48h逐漸回復(fù)至對照組水平。EphA4也有缺血誘導(dǎo)的增高，再灌后6h與對照組相比即有明顯增高（2.21±0.12vs 0.72±0.03，P＜0.05），之后逐漸下降，再灌注后24h與對照相比仍有明顯差異，至48h與對照組相比無明顯差異。

3 討 論

海馬腦區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中具有重要作用，但其對缺血損傷極為敏感，尤以CA1區(qū)為著。在缺血／再灌注過程中，海馬神經(jīng)元受到多種因素的損傷刺激后，如興奮性神經(jīng)毒素、氧化應(yīng)激、炎癥，而發(fā)生死亡。在缺血后極短的時(shí)間內(nèi)，由于能量供應(yīng)急劇減少，依賴ATP的各種功能障礙很快出現(xiàn)，首先表現(xiàn)為離子梯度的改變，膜的去極化，以及細(xì)胞外谷氨酸及其他神經(jīng)遞質(zhì)的升高［1］，繼之以胞內(nèi)鈣的升高，啟動(dòng)了細(xì)胞死亡過程［2，3］。如果缺血過程較為短暫，則細(xì)胞死亡主要表現(xiàn)為遲發(fā)性的神經(jīng)元死亡［4］。

海馬區(qū)酪氨酸激酶受體－配體（Eph－ephrin）在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用中扮演了重要的角色。Eph及ephrin均為膜蛋白，通過Eph向細(xì)胞內(nèi)傳遞的信號稱為正向信號，通過其配體ephrin的信號稱為反向信號。它們參與正常組織中血管生成、組織邊界形成、細(xì)胞遷移、軸突導(dǎo)向和塑型以及骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等［5，6］。

ephrinA3是成年海馬區(qū)最為豐富的ephrin－A配體。ephrinA3標(biāo)記主要位于GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞上。在腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrinA3與神經(jīng)元EphA4之間的相互作用可調(diào)節(jié)突觸后神經(jīng)元形態(tài)［7，8］

本研究發(fā)現(xiàn)，在缺血／再灌注后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性死亡，TUNEL染色可見有大量凋亡神經(jīng)元，而Caspase 3的活性在CA1也有顯著增高。在CA1區(qū)錐體神經(jīng)元，再灌注后caspase 3的過表達(dá)與錐體神經(jīng)元DNA斷裂及遲發(fā)性死亡是密切相關(guān)的。在單純?nèi)毖俟嘧⒔Mcaspase 3活性升高。同時(shí)在再灌注后6h，海馬CA1區(qū)ephrinA3即有顯著升高，之后逐漸下降，這種缺血誘導(dǎo)的ephrinA3表達(dá)增高與Pulkkinen等在局灶性腦缺血中觀察到的結(jié)果一致，即缺血可以誘導(dǎo)海馬區(qū)ephrinA3的表達(dá)。對照側(cè)海馬CA3區(qū)也有表達(dá)，但較缺血側(cè)明顯較低，且表達(dá)方式也不同［9］。EphA4在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)［10，11］。本研究觀察到EphA4在缺血／再灌注后的海馬CA1區(qū)也有升高，這表明ephrinA3／EphA4可能參與了缺血后的病理過程，推測與以下一些因素有關(guān)。首先，ephrinA3與EphA4的上調(diào)通過對突觸間隙谷氨酸濃度調(diào)節(jié)，影響了缺血／再灌注后的興奮毒效應(yīng)。前腦缺血可引起大鼠或沙土鼠海馬谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（glutamate transporter 1，GLT－1）表達(dá)減少，以及功能減弱，但不影響 GLAST（glutamate－aspartate transporters）的表達(dá)，這一現(xiàn)象先于神經(jīng)元遲發(fā)性死亡發(fā)生。而GLT－1主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)［12－15］。有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞上過表達(dá)ephrinA3可降低膠質(zhì)細(xì)胞上谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量，由此可調(diào)節(jié)突觸谷氨酸濃度及突觸后去極化，調(diào)節(jié)LTP［16］。EphA4與ephrinA3相互作用，可以下調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及減少谷氨酸攝取，ephrinA3的反向信號也可以抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。研究者以EphA2Fc（只與ephrin－A結(jié)合。EphA4還可與ephrin－B2結(jié)合）來結(jié)合ephrinA3，在野生型大鼠引起顯著的谷氨酸攝取下降，同時(shí)引起 GLT－1與 GLAST水平下降［17］。

在腦缺血／再灌注過程中，興奮毒是神經(jīng)元重要的損傷機(jī)制，EphA4與ephrinA3的表達(dá)上調(diào)，并且，有研究表明二者的結(jié)合可抑制谷氨酸攝取。星形膠質(zhì)細(xì)胞是突觸間隙谷氨酸濃度的重要調(diào)控者，缺血／再灌注中其ephrinA3表達(dá)的上調(diào)可造成谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的數(shù)量及功能的下降，其對于興奮毒的加劇可能起了推波助瀾的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，短暫腦缺血／再灌注可誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)ephrinA3與EphA4的表達(dá)明顯增高，其時(shí)間過程與Caspase增高的時(shí)間過程一致，這可能是CA1細(xì)胞對腦缺血易損的一個(gè)重要機(jī)制。

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