臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療帕金森病的研究進(jìn)展

武曉華,陳乃耀

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,該病主要病理特點為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neuron,DN)嚴(yán)重缺失和紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)減少。目前臨床以藥物治療和手術(shù)治療為主[1]。不論是遞質(zhì)替代還是外科手術(shù)均不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性,不能重新增加多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目。相反,由于左旋多巴的神經(jīng)毒性、電極的刺激還會使神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)一步減少。因此,尋求一種從病理基礎(chǔ)上提高神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞數(shù)目的治療具有重要意義[2]。成體干細(xì)胞橫向分化的多潛能性為 PD的治療提供了新的思路和方法[3]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)是從臍帶血中分離和培養(yǎng)的一種多潛能成體干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,在一定條件下可以分化成為神經(jīng)元細(xì)胞。目前,根據(jù)UCB-MSCs的這些特性,應(yīng)用UCB-MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病,神經(jīng)損傷和中風(fēng)等的基礎(chǔ)和臨床研究已成為熱點,并取得了一定進(jìn)展。

1 UCB-MSCs的生物學(xué)特性

人臍血是指臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液,含有豐富的干細(xì)胞和前體細(xì)胞,其主要包含造血干細(xì)胞和MSCs。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)臍血中含有豐富的MSCs,其特性主要有:①細(xì)胞形態(tài)呈均一的長梭形,核漿比例大,細(xì)胞內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器,端粒酶活性高,增殖能力強(qiáng),具有貼壁生長的特點;②適當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,具有譜系內(nèi)多向分化的特點和跨系分化的潛能;③表達(dá) CD13、CD29、D44、CD54、CD58、CD90、CD95、CD105、CD166等免疫表型,不表達(dá) CD14、CD34、CD40、CD45、CD50、CD68、CD80、CD86、CD117和 CD152等免疫表型;④強(qiáng)陽性表達(dá)抗原標(biāo)記SH-2、SH-3、SH-4(人間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗體),同時表達(dá)HLA-ABC等抗原和膠原Ⅰ,不表達(dá)HLA-DR抗原、共刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40/CD40L以及膠原Ⅱ、Ⅲ;⑤細(xì)胞多處于G0/G1期,具有良好的增殖分化能力,簡便易行的分離、純化程序,而且能分泌一些造血細(xì)胞因子,具有促進(jìn)造血的作用;⑥是一種原始的免疫缺陷細(xì)胞,具有良好的免疫耐受性,同時有一定的免疫調(diào)節(jié)作用,能夠抑制T細(xì)胞活性。

2 UCB-MSCs應(yīng)用于細(xì)胞移植所具備的條件

UCB-MSCs可應(yīng)用于細(xì)胞移植,因其具備以下優(yōu)點:①來源廣泛,采集方便,不會對供者造成任何傷害。②其中的干/祖細(xì)胞較骨髓中的干/祖細(xì)胞更原始,增殖分化能力更強(qiáng)。③淋巴細(xì)胞的免疫功能不夠成熟,移植物抗宿主病發(fā)生率較低。④微生物和腫瘤細(xì)胞污染的可能性小。⑤無社會、倫理及法律等方面的諸多爭議。⑥易于保存和運輸。⑦收集的臍血不僅可做異基因移植的供體,而且還可將之低溫保存數(shù)十年,用于自體移植治療相關(guān)疾病。這些優(yōu)點使UCB-MSCs成為細(xì)胞移植理想的種子細(xì)胞,有著廣泛的臨床應(yīng)用前景。

3 UCB-MSCs向DN分化的研究

研究表明,在特定的條件下,UCB-MSCs經(jīng)過誘導(dǎo)在體內(nèi)和體外均可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,并表達(dá)一些神經(jīng)標(biāo)志性蛋白。UCB-MSCs的分化機(jī)制還不完全清楚,UCB-MSCs在其細(xì)胞的基因組內(nèi)有幾套“程序”,在不同的外界環(huán)境下,會有相應(yīng)的一套基因開啟,從而分化成某種終末細(xì)胞;還有人認(rèn)為 UCB-MSCs是通過與不同組織的細(xì)胞發(fā)生融合而實現(xiàn)向該組織分化的,UCB-MSCs跨胚層分化時需要通過細(xì)胞融合這一過程來最終分化成這些組織的特定細(xì)胞。

3.1 UCB-MSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞 近年來,國內(nèi)外學(xué)者對UCB-MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法進(jìn)行了大量研究,目前UCB-MSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法主要有:①細(xì)胞生長因子法,神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等;②化學(xué)誘導(dǎo)劑法,B-巰基乙醇(B-ME)、二甲基亞砜(DM SO)、丁羥基苯甲醚(BHA)等;③生長因子與化學(xué)誘導(dǎo)劑聯(lián)合;④其他,共培養(yǎng)或用接近生理狀態(tài)的條件培養(yǎng)液、基因轉(zhuǎn)染[4]、傳統(tǒng)中藥黃芩苷[5]等。Goodwin等[6]將第4代的UCB-MSCs以完全培養(yǎng)基加20 ng/mL bFGF,20 ng/mL EGF誘導(dǎo)7 d細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細(xì)胞免疫化學(xué)及Westen blot均證實有細(xì)胞骨架蛋白B-tubulinⅢ,星形細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)。侯玲玲等[7]以DM EM/20%胎牛血清/和B-巰基乙醇(B-M E)預(yù)誘導(dǎo) 24 h,而后換二甲基亞砜(DMS0)和丁羥基苯甲醚(BHA)進(jìn)行誘導(dǎo)UCB-MSCs 5 h后70%細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣表型,免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)不同代數(shù)的MSCs均為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)微絲蛋白M(NF-M)陽性,誘導(dǎo)6 h～8 h后組織化學(xué)檢測可見神經(jīng)元特有結(jié)構(gòu)尼氏體。Sanchez等[8]在N5神經(jīng)生長培養(yǎng)基中,采用維甲酸(RA)和 NGF誘導(dǎo) UCB-MSCs后,新生細(xì)胞在形態(tài)上接近神經(jīng)細(xì)胞,并表達(dá)神經(jīng)巢蛋白(nestin)、GFAP、NSE等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。Jeong等[9]用 bFGF預(yù)誘導(dǎo)后,再用 DMSO、BHA聯(lián)合誘導(dǎo) UCB-MSCs,細(xì)胞迅速向神經(jīng)細(xì)胞快速分化,誘導(dǎo)后細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形狀,免疫熒光檢測顯示,神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志巢蛋白呈陽性,成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。

以上研究證明,UCB-MSCs在不同培養(yǎng)條件或不同的因子作用下,可分化為具有神經(jīng)元形態(tài)并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物的細(xì)胞,體外誘導(dǎo)UCB-MSCs的技術(shù)正趨于完善。

3.2 UCB-MSCs在體內(nèi)向神經(jīng)細(xì)胞分化 Dunyue等[10]在HUCB對腦外傷鼠模型的靜脈治療中取得成功,并在腦實質(zhì)中檢測到被標(biāo)記的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。Ha等[11]和Chen等[12]將HUCB-MSCs靜脈輸注到大腦中動脈梗死(MCAO)大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)移植的M SCs存活,部分表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP、NeuN、MAP-2,接受移植的動物運動功能和NSS均有顯著改善。Willing等[13]將UCB-MSCs移植入局灶性腦缺血成年大鼠24 h后觀察到,成年大鼠記憶功能改善。吳芳等[14]對小兒腦癱患者應(yīng)用 UCB-MSCs鞘內(nèi)注入的治療方法,1次/周,治療4周后患兒的粗大運動功能中臥位與翻身、坐位、行走與跑跳功能及小腿三頭肌肌張力均得到明顯改善。

UCB-MSCs通過不同方式移植到動物模型體內(nèi),可在體內(nèi)微環(huán)境中分化為神經(jīng)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞,并使運動功能明顯改善。UCB-MSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)分化形成的神經(jīng)元樣細(xì)胞在移植后仍可存活、增殖并遷移。

4 UCB-MSCs移植治療PD的研究現(xiàn)狀

4.1 UCB-MSCs移植治療PD的研究 細(xì)胞移植治療PD的目的是修復(fù)黑質(zhì)神經(jīng)元變性引起的紋狀體多巴胺能通路損傷。移植DN替代已經(jīng)變性的神經(jīng)元,恢復(fù)黑質(zhì)紋狀體多巴系統(tǒng)的完整性并改善其功能,很可能是一項非常有前途的治療措施[15]。吳立克等[16]給患者應(yīng)用 UCB-MSCs進(jìn)行鞘內(nèi)注射移植治療,以第3,4腰椎間隙為穿刺點,緩慢注入地塞米松2 mg,取UCB-MSCs注射液5 mL(干細(xì)胞數(shù) 500萬),在10 min內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔,1次/周,4次為1個療程,共治療1個療程?？梢砸欢ǔ潭鹊馗纳芇D患者的臨床癥狀,提高患者生活質(zhì)量。黃仕雄等[17]利用 Nurrl基因修飾HUCB-MSC來源的DN,移植入PD模型鼠紋狀體內(nèi),能有效地改善PD模型鼠的癥狀,提高移植后DN的整合及存活能力,保護(hù)了毀損紋狀體內(nèi)殘存的DN。Fu等[18]研究報道,將源于人臍血的 MSCs在體外誘導(dǎo)分化成為DN,把轉(zhuǎn)化來的細(xì)胞移植到大鼠體內(nèi)(這種大鼠是通過施加6-OH多巴胺神經(jīng)毒素而人造的單側(cè)紋狀體損害的PD模型),在移植后的4個月,酪氨酸羥化酶染色在大鼠的新紋狀體內(nèi)檢測到了移植的細(xì)胞,結(jié)果顯示,UCB-MSCs有可能用于治療PD。樊志剛等[19]將第三代 UCB-MSCs用Hoechst33258標(biāo)記后植入大鼠紋狀體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植組較對照組阿撲嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為顯著改善,認(rèn)為UCB-MSCs腦內(nèi)移植能改善帕金森大鼠的行為缺陷,可作為治療神經(jīng)變性性疾病的一種潛在的細(xì)胞資源。

4.2 UCB-MSCs治療PD的可能機(jī)制 盡管UCB-MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)的許多疾病如:腦梗死、腦損傷、脊髓損傷、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的細(xì)胞移植治療方面取得了很大的進(jìn)展,但其在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)方面的作用機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為UCBMSCs治療 PD的機(jī)制可能有:①UCB-MSCs移植入腦后,能形成表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志性蛋白的神經(jīng)元樣細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞,產(chǎn)生的細(xì)胞可在受損部位周圍存活,甚至移行至全腦[20]。②UCBMSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境下能分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、bFGF等營養(yǎng)因子,或者刺激損傷部位產(chǎn)生內(nèi)源性因子,促進(jìn)損傷組織的修復(fù)并減少細(xì)胞凋亡。③UCB-M SCs是受損部位新生血管的主要組成細(xì)胞,可分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì),幫助神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)血管發(fā)生[21]。④在腦內(nèi)創(chuàng)造適宜的局部微環(huán)境,通過體外擴(kuò)增或不同因子誘導(dǎo)分化的方法使UCB-MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞后進(jìn)行移植,替代受損細(xì)胞重建神經(jīng)功能區(qū)和傳導(dǎo)通路[22]。

4.3 UCB-MSCs移植的方法及影響因素

4.3.1 移植途徑和方法 UCB-MSCs移植的途徑有:通過腦立體定位儀將 UCB-MSCs注入側(cè)腦室、紋狀體、海馬等;直接注射入腦室或蛛網(wǎng)膜下腔,通過腦脊液的流動將細(xì)胞帶到病變部位;注射入靜脈或動脈,使其通過血腦屏障到達(dá)病變部位,主要應(yīng)用于鼠尾靜脈注射。

UCB-MSCs移植治療PD的方法主要有:一是將未誘導(dǎo)或修飾過的UCB-MSCs直接移植入體內(nèi),利用體內(nèi)環(huán)境的信號誘導(dǎo)分化為合適的細(xì)胞[16]。另外一種方法是移植經(jīng)過誘導(dǎo)或基因修飾過的UCB-MSCs,使其分化為所需要的神經(jīng)細(xì)胞后再移植入體內(nèi)[17]。

4.3.2 影響因素 UCB-MSCs的選取、分離培養(yǎng)方法,分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率,移植細(xì)胞的類型、數(shù)量、合適的比例、合適的移植位點,UCB-MSCs對細(xì)胞外環(huán)境的影響以及細(xì)胞外環(huán)境對UCB-MSCs的影響,腦中內(nèi)源性因子的作用以及UCB-MSCs在腦內(nèi)存活時間對移植療效均有一定的影響。Karen等[23]發(fā)現(xiàn),UCB-MSCs分離較為合適條件是,樣本保存時間不超過15 h,樣本中血液體積要超過33 mL,并且血液中沒有血凝塊合胰酶,單份血液中的 MSC要超過108。Buzanska等[24]將貼壁后的UCB-MSCs在含EGF培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周,獲得nestin陽性的細(xì)胞集落,隨后將這種細(xì)胞分別用多聚左旋賴氨酸、視黃酸和BDNF誘導(dǎo),可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞;若與大鼠腦原代培養(yǎng)單層細(xì)胞共培養(yǎng),也可獲得神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Fu等[18]通過實驗發(fā)現(xiàn),源于人臍血的MSCs在神經(jīng)培養(yǎng)基(NCM)、SHH、FGF8中通過分步培養(yǎng),可以誘導(dǎo)分化成為12.7%的DN,移植至PD模型鼠紋狀體后,旋轉(zhuǎn)數(shù)顯著減少至對照組的水平,但不能恢復(fù)到正常水平,移植的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量不足是其主要原因,熒光顯示跟蹤發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的細(xì)胞大多定位于前囟點前2.0到后0.6,從移植位置開始遷移了大約1.4 mm,幾乎貫穿了整個紋狀體。Sawamoto等[25]研究發(fā)現(xiàn)人臍血來源MSCs能夠在實驗組大鼠腦內(nèi)長期存活(至少8周以上),且發(fā)生遷移,同時表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞抗原 NSE,GFAP,T H,并且實驗組多巴胺含量明顯增加,這表明MSCs在大鼠腦內(nèi)微環(huán)境的作用下可模仿神經(jīng)干/祖細(xì)胞的行為。因此在臨床應(yīng)用研究中除了用UCB-MSCs誘導(dǎo)分化而來的細(xì)胞替代缺乏或喪失功能的細(xì)胞外,也應(yīng)該考慮聯(lián)合培養(yǎng)多種細(xì)胞來重塑細(xì)胞外環(huán)境,從而提高移植細(xì)胞的存活和增殖分化的能力。

5 展 望

目前雖然對UCB-MSCs的研究已取得了較大進(jìn)展,其在人類醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價值也已逐漸得到了肯定,但UCB-MSCs的研究尚處于起步階段,仍存在許多尚待解決:尚未尋找到完善的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增UCB-MSCs的方案。至今尚未篩選到其特異性的標(biāo)記分子,仍未能建立鑒定 UCB-MSCs的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。誘導(dǎo)UCB-MSCs向多系分化的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在UCBMSCs的臨床應(yīng)用中,哪一分化階段的細(xì)胞最適于移植?采用何種途徑進(jìn)行移植最佳?有待于進(jìn)一步的探討。在移植應(yīng)用過程中,植入的UCB-MSCs分化生成的細(xì)胞是否能夠融入相應(yīng)的組織器官并發(fā)揮特定功能,具體作用機(jī)制如何?UCB-MSCs移植的近遠(yuǎn)期安全性問題,有無致瘤性等也亟待更完善的解決方案。UCB-MSCs治療PD能否保持長期療效,且與目前存在的其他治療方法相比是否具有優(yōu)越性?還有待進(jìn)一步分析。盡管目前UCB-MSCs作為一種真正意義上的種子細(xì)胞還存在許多研究空白,但UCB的優(yōu)勢是其他取材來源所無法比擬的。相信隨著UCB-MSCs研究的深入,其生物學(xué)特性會越來越明晰,在細(xì)胞治療、基因治療、組織工程及器官移植方面都會產(chǎn)生不可替代的作用。

[1]Lees AJ,Hardy J,Revesz T.Parkinson's disease[J].Lancet,2009,373(9680):2055-2066.

[2]Greene P.Cell-based therapies in Parkinson's disease[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2009,9(4):292-297.

[3]Lindvall O,Kokaia Z.Prospects of stem cell therapy for replacing dopamine neurons in Parkinson's disease[J].T rends Pharmacol Sci,2009,30(5):260-267.

[4]Jin GZ,Yin XJ,Yu XF,etal.Generation of neuronal-like cells from umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells of aRFP-transgenic cloned cat[J].Vet Med Sci,2008,70(7):723-726.

[5]管讓憲,顏小華,陳啟文,等.中藥單體黃芩苷體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(14):2787-2792.

[6]Goodwin HS,Bickness A,Chien S,et al.M ultilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood:Expression of bone,fat,and neural markers[J].Biol B1ood Marrow Transplang,2001,7:581-588.

[7]侯玲玲,曹華,魏國榮,等.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究[J].中華血液學(xué)雜志,2002,23(8):415-419.

[8]Sanchez-Ramos J,Song S,Kamath SG,et al.Expression of neural markers in human umbilical cord blood[J].Exp Neurol,2001,171(1):109-115.

[9]Jeong JA,Cang EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differentiaton of human cord blood-derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport,2004,15(11):173l-1734.

[10]Dunyue L,Paul R,Sanberg AM,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury[J].Cell T ransplantation,2002,11:275-281.

[11]Ha Y,Choi JU,Yoon DH,et al.Neural phenotype expression of cultured human cord blood cells in vitro[J].Neuroreport,2001,12(16):3523-3530.

[12]Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[13]Willing AE,Lixian J,Milliken M,et al.Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke[J].J Neurosci Res,2003,73(3):296-307.

[14]吳芳,楊佳勇,張敏,等.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦性癱瘓兒童神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響:20例分析[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(16):3198-3200.

[15]Hou L,Hong T.Stem cells and neurodegenerative diseases[J].Sci China C Life Sci,2008,51(4):287-294.

[16]吳立克,王曉娟,褚賽純,等.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病30例[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(40):7951-7954.

[17]黃仕雄,劉軍,文國強(qiáng),等.Nurrl基因修飾人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞源性多巴胺能神經(jīng)元移植治療帕金森病[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2009,30(5):522-526.

[18]Fu YS,Cheng YC,Lin M Y,et al.Conversion of human umbilical co rd mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopaminergic neurons in vitro:Potentialtjal therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells,2006,24(1):115-124.

[19]樊志剛,劉翔,白瑞櫻,等.臍血干細(xì)胞移植對帕金森病大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,41(4):646-648.

[20]Jin GZ,Cho SJ,Choi EG,et al.Rat mesenchymal stem cells increase tyrosine hy droxylase expression and dopamine content in ventral mesencephalic cells in vitro[J].Cell Biol Int,2008,32(11):1433-1438.

[21]Kim YJ,Park HJ,Lee G,et al.Neuroprotective effects of humanmesenchymal stem cells on dopaminergic neurons through anti-inflammatory action[J].Glia,2009,57(1):13-23.

[22]Bouchez G,Sensebe L,Vourch P,et al.Partial recovery of dopaminergic pathway after graft of adult mesenchymal stem cellsin a rat model of Parkinson's disease[J].Neurochem Int,2008,52(7):1332-1342.

[23]Karen,Susanne,Kluter H,et al.Critical parameters for the isolation of mesenchy mal stem cell from umbilical co rd blood[J].Stem Cells,2004,22(9):625.

[24]Buzanaka L,Machaj EK,Zablocka B,et al.Human cord blood-derived cells attain neuronal and g lial features in vitro[J].J Cell Sci,2002,115:2131-2138.

[25]Sawamoto K,Nakao N,Kakishita K.Generation of dopaminergicneurons in the adult brain from mesencephalic precursor cells labeled with a nestin-GFP transgene[J].J Neurosci,2001,21(11):3895.