非洲綠猴腎上皮細胞損傷及誘導草酸鈣晶體

劉愛潔， 歐陽健明

(暨南大學生物礦化與結石病防治研究所， 廣東 廣州 510632)

0 引 言

泌尿系結石已經(jīng)成為一種常見的疾病，世界上幾乎5%～12%的人口受到其影響[1-3]，結石的種類有多種，其中草酸鈣是尿路結石中最常見的組分，在中國以草酸鈣為主要成分的結石治愈后復發(fā)率高達60%～80%.目前醫(yī)學認為尿液中草酸鈣晶體的成核、生長、聚集是尿草酸結石形成的主要機制[4].細胞與晶體的相互作用是一水草酸鈣(COM)腎結石形成的主要機制之一，且促進COM晶體粘附到腎小管上皮細胞表面的陰離子上[5-7].細胞損傷與晶體粘附的相互作用是：一方面，晶體的粘附導致細胞的內部損傷，引起細胞內的一系列反應，包括自由基和活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生，即過氧自由基(O2-)、過氧化氫非自由基(H2O2)和羥基陰離子等,這些分子能夠改變細胞膜脂類、DNA、線粒體和細胞的結構和成分；草酸鈣晶體進一步粘附可以改變基因的表達，導致細胞表面蛋白表達量的變化和細胞的凋亡或壞死[8].另一方面，細胞受損傷后，細胞膜內的磷酯酰絲氨酸(PS)外翻，并在膜表面表達透明質酸等功能分子，為初始晶體的異質成核提供粘附位點，誘導或加劇了草酸鈣晶體的成核、生長與聚集.目前細胞損傷不同程度時誘導草酸鈣晶體形成的情況并未報道，因此本文研究了不同濃度、不同時間的H2O2誘導非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)的損傷及其誘導草酸鈣晶體的形成.

1 實驗部分

1.1 試劑

非洲綠猴腎上皮細胞株(Vero) (暨南大學生物制藥基地),培養(yǎng)液DMEM-F12(Hyclone, ?？寺∩锘瘜W制品(北京)有限公司)，新生小牛血清(Hyclone，?？寺∩锘瘜W制品(北京)有限公司)，超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所),細胞增生分析試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(日本同仁化學研究所),線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(碧云天生物技術研究所),過氧化氫、氯化鈣與草酸鉀均為分析純(廣州化學試劑廠).

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

非洲綠猴腎上皮細胞株(Vero)用含10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng).培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度.Vero傳代采用胰蛋白酶消化法.細胞達80%～90% 融合后用D-Hanks液洗滌2次，加入0.25%胰酶消化液，置37 ℃約3～5 min后，在顯微鏡下觀察消化程度，消化適度后加入10%新生小牛血清的DMEM～F12培養(yǎng)液終止消化，吹打分散，使細胞脫離瓶壁并形成單細胞懸液.

1.2.2 細胞損傷前后活力的檢測

1.2.3 流式細胞儀對線粒體膜電位的檢測

按細胞濃度為2×105cells/mL、每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板，用含10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育，使細胞匯合成單層，實驗前換為無血清的DMEM-F12使Vero同步化12 h.將上述細胞分成A、B兩組：A組為正常對照細胞,B組為細胞損傷組.A組為正常對照組,只加入無血清培養(yǎng)液.B組加c(H2O2) = 0.3 mmol/L的無血清培養(yǎng)液，與細胞分別作用0.5 h、1.0 h、2 h,或c(H2O2) = 0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L的無血清培養(yǎng)液與細胞各作用1 h.到達作用時間以后，吸除上清液，用D-Hanks液洗滌2次，用0.25%胰酶消化后，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打細胞，使細胞懸浮，然后離心(1 000 r/min) 5 min，吸除上清液，用PBS洗滌一次，重新離心，得到細胞沉積物,然后進行線粒體膜電位的測定：在得到的細胞沉積物中加入200 μL PBS溶液，吹打使之均勻重懸后移入EP管中，樣品用JC-1染料染色后上機測試.

1.2.4 電子掃描電鏡(SEM)觀察細胞損傷前后誘導草酸鈣晶體的形成

調整細胞濃度為1×105cell/mL，每孔1 mL細胞懸浮液接種于底部鋪有蓋玻片的12孔板中，加入10%新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后細胞已基本鋪滿蓋玻片.吸除培養(yǎng)液，改用無血清DMEM-F12培養(yǎng)液孵育12 h，使細胞同步化,然后吸除上清液，用D-Hanks洗滌細胞2次.將孔板上的細胞分為兩大組：A組為正常對照組,B組為損傷組.A組加入無血清培養(yǎng)液,B組加入c(H2O2) = 0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L的無血清培養(yǎng)液，與細胞各作用1 h.此后吸除所有培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗滌細胞2次.再向上述對照組和損傷細胞中分別加入含CaOxa過飽和溶液的無血清培養(yǎng)液，使CaOxa最終濃度為0.5 mmol/L.將12孔板置37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育一定時間6 h后，取出蓋玻片，用D-Hanks液洗滌細胞2、3次，然后用2.5%的戊二醛在4 ℃條件下固定24 h.固定后的細胞依次用50%、70%、90%、100%的乙醇脫水，再用乙酸異戊酯固定后于CO2臨界干燥樣品，噴金處理，SEM觀測細胞形態(tài)和晶體生長情況.

2 結果與討論

2.1 細胞損傷前后活力的變化

通過測定細胞的活力，表明H2O2對Vero細胞的損傷程度依賴于作用時間和H2O2的濃度，且濃度對細胞的影響大于時間的影響，這也為建立H2O2對Vero細胞的損傷模型奠定了基礎.

結果如表1所示.當用c(H2O2) = 0.3 mmol/L的無血清培養(yǎng)液作用于細胞時，隨著損傷時間(t)的延長，細胞的活力降低(以正常細胞的生長率作為對照100%).當c(H2O2)分別為0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L，作用時間t=1 h時，隨著c(H2O2)增加，細胞活力越來越低.Wiseman 等[9]報道，將肺動脈內皮細胞急性暴露于氧化應激引起鋅離子穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體功能障礙，激活凋亡.由此可知，本實驗結果與此一致，H2O2對細胞作用的時間和濃度都會對細胞造成不同程度的影響.

表1 H2O2不同濃度和時間對VERO細胞的存活率的影響

2.2 細胞損傷前后線粒體膜電位的變化

如圖1a所示，用濃度為0.3 mmol/L的H2O2損傷細胞不同時間時，在前1 h時，膜電位急速降低；隨著時間的延長，降低趨勢趨于緩慢，總體是線粒體的膜電位逐漸降低.當用不同濃度的H2O2作用細胞1 h時(圖1b)，隨著H2O2濃度的增加，線粒體膜電位急劇下降.有研究表明，過量H2O2的毒性效應是通過誘發(fā)脂質過氧化反應，線粒體膜流動性下降，細胞膜和線粒體膜通透性改變，Ca2+大量流入細胞和線粒體，導致鈣超載，激活多種信號轉導途徑而觸發(fā)凋亡[10].本實驗H2O2損傷細胞后所引起的線粒體膜電位的變化與上述結果一致.

2.3 Vero細胞損傷前后誘導草酸鈣晶體的形成的觀察

圖1 H2O2濃度(a)和作用時間(b)對對Vero線粒體膜電位的影響

如圖2所示為正常細胞和不同濃度H2O2損傷的細胞誘導Caoxa晶體的SEM圖.正常Vero誘導的CaOxa晶體不僅尺寸小，而且量也很少 (圖2a).經(jīng)H2O2損傷后的細胞，由于損傷程度不同，導致Vero細胞誘導CaOxa晶體的能力也不同，當c(H2O2) = 0.3 mmol/L損傷細胞1 h時，細胞的損傷程度較小，但細胞的形態(tài)已經(jīng)有一些變化，細胞開始變的干癟，但是并不是太明顯，細胞表面所誘導的晶體量相對正常細胞有所增加(圖2b).隨著c(H2O2)的增加，細胞的損傷程度逐漸加重，細胞逐漸失去了原來的形態(tài)，細胞表面粗糙，細胞表面的纖毛脫落，細胞收縮干癟，細胞之間的緊密連接被破壞，增加了與晶體結合的表面積，且細胞表面結合的晶體量逐漸增多(圖2c)，當c(H2O2) = 0.5 mmol/L時，有一些細胞已經(jīng)開始內吞晶體，而隨著濃度的增加，有大量晶體已經(jīng)被細胞完全包被(圖2d).當c(H2O2) = 3 mmol/L時，細胞完全失去了形態(tài)，細胞表面被晶體所包圍(圖2e).

圖2 不同損傷程度的Vero細胞誘導生成的CaOxa晶體的形貌(c(H2O2): (a) 0 mmol/L; (b) 0.3 mmol/L; (c) 0.5 mmol/L; (d) 1.0 mmol/L; (e) 1.5 mmol/L; (f) 2.0 mmol/L; (g) 3.0 mmol/L.c(CaOxa)=0.5 mmol/L; 結晶時間: 6 h)

對H2O2作用Vero細胞的損傷情況有了一個基本的了解后，我們開始研究其損傷細胞在過飽和的CaOxa溶液中誘導CaOxa晶體的形成情況.因為通過上面一系列的實驗，我們發(fā)現(xiàn)H2O2的濃度變化對細胞的損傷程度影響較大，所以我們選擇了不同濃度H2O2損傷Vero細胞后誘導CaOxa晶體的形成.正常細胞表面的一些分子，如檸檬酸鹽、腎鈣蛋白等可以抑制草酸鈣晶體的粘附[5-13].而許多實驗證明，當細胞受損傷后，細胞的微結構發(fā)生了變化，細胞會在細胞表面表達大量的帶負電荷的物質，如磷酯酰絲氨酸(PS)、透明質酸、骨橋蛋白(OPN)、唾液酸、膜連蛋白II等[14,15]，建立了一個負電荷的壞境，誘導CaOxa晶體的成核、生長、聚集或轉換[14].

3 結 論

我們采用非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)為研究對象, 以H2O2作為誘導損傷因素，研究了其不同時間、不同濃度對Vero細胞損傷機制的變化，建立了Vero細胞的氧化損傷模型，為后面的損傷細胞誘導CaOxa晶體的研究提供了依據(jù).研究結果表明，損傷程度不同的Vero細胞在過飽和的CaOxa溶液中，誘導CaOxa晶體的情況存在差異，細胞損傷程度越嚴重，就會誘導和內吞越多的CaOxa晶體，這為腎結石的醫(yī)學研究提供了理論依據(jù).

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