表沒食子兒茶素沒食子酸酯對亞硫酸鹽誘導(dǎo)的心肌細胞氧化損傷的抑制作用

趙良淵，張秋華

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001;2.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院 030006)

綠茶常被稱為是天然的抗氧化劑，含有很多種酚類物質(zhì)，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最高且生物活性最強。流行病學(xué)調(diào)查和實驗室研究表明，EGCG具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗腫瘤等功效［1-2］，如在日本等飲茶較多的國家或地區(qū)，冠心病等心血管疾病的發(fā)病率是非常低的［3］。近年來，關(guān)于EGCG 的抗氧化機制被廣泛接受的是具有較強的抗氧化能力［4］。關(guān)于EGCG對心血管系統(tǒng)的保護機制報道不多，本實驗主要研究了EGCG對亞硫酸鹽誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1動物實驗動物Wistar大鼠，200～300 g，♀♂不限，由山西省中醫(yī)藥研究院動物房提供。

1.2大鼠心肌細胞的分離Wistar大鼠，體質(zhì)量200～300 g，♀♂不限，具體分離方法見參照Wei等［5］。所有實驗應(yīng)在細胞分離后的12 h內(nèi)完成。

1.3試劑亞硫酸鈉(Na2SO3)，亞硫酸氫鈉(NaHSO3)，?；撬?Tau)，L-谷氨酸(L-Glu)，牛血清蛋白(BSA)，HEPES，MgATP，CsCl，EGTA，EGCG 購 自 Sigma 公 司 (純 度 ＞99.8%)，膠原酶P(Collagenase P)購自Roche公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。配制2 mol·L-1的NaHSO3和Na2SO3混合液(二者摩爾比為1∶3)、2 g·L-1EGCG的母液，實驗前稀釋到需要濃度。

1.4SOD、CAT、GPx活性的測定消化結(jié)束后，取分離完成的細胞懸液2 ml，先用10 μmol·L-1的亞硫酸鹽染毒30 min，后分別加入 10、30、50 mg·L-1EGCG 處理 40 min。染毒結(jié)束后用超聲波細胞破碎儀破碎細胞，于4℃ 4 000 r·min-1離心15 min。取上清液，測定總SOD，CAT，GPx的活性(按試劑盒說明書操作)。實驗同時設(shè)對照和亞硫酸鹽單獨染毒各一組。

1.5·含量的測定同樣取細胞破碎上清液，按照南京建成試劑盒測定H2O2，OH·及含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析所有試驗結(jié)果用±s表示，用one-way ANOVA檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對SOD活性的影響10 μmol·L-1的亞硫酸鹽明顯降低了SOD的活性(12.69±0.14)U·ml-1，與對照相比(23.83±0.23)U·ml-1(P＜0.01)，差異有顯著性。在加入10、30、50 mg·L-1的EGCG后，SOD活性隨著EGCG濃度的增加逐漸回升，其含量分別為對照的63%，67%和86%。EGCG 50 mg·L-1時SOD活性與對照相比差異無顯著性(P＞0.05)，但是與亞硫酸鹽單獨作用比較，差異有顯著性(P＜0.05)。

2.2 EGCG對CAT活性的影響10 μmol·L-1亞硫酸鹽降低了CAT活性至對照的69%(P＜0.05)。之后，心肌細胞用不同濃度的EGCG處理后，當(dāng)EGCG濃度為30 mg·L-1時，CAT的活性僅僅被抑制了41%，該數(shù)值與亞硫酸鹽單獨作用比較差異有顯著性(P＜0.05)，而當(dāng)EGCG的處理濃度為50 mg·L-1，亞硫酸鹽則未能抑制CAT的活性，即與對照相比差異無顯著性(P＞0.05)，CAT活性為(1.09±0.48)U·mg-1Pro，為對照的76%，但與亞硫酸鹽單獨作用比較則差異有顯著性(P＜0.01)。

2.3 EGCG對 GPx活性的影響GPx活性在10 μmol·L-1亞硫酸鹽處理后與對照相比降低(P＜0.01)。然而，GPx活性隨著EGCG濃度的增加而提高。在EGCG 30 mg·L-1時，GPx活性為對照的67%。在EGCG 50 mg·L-1處理中，GPx活性為26 U·ml-1，是對照的84%，但與亞硫酸鹽單獨作用比較，差異有顯著性(P＞0.05)。

亞硫酸鹽處理后，OH·和H2O2的累積量不斷增加，分別為對照的1.53，1.40和2.13倍(P＜0.01)。在用EGCG處理后，亞硫酸鹽誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基受到抑制。在30 mg·L-1EGCG處理中，僅僅H2O2水平與對照相比仍有提高，而和 OH·的含量與對照相比無統(tǒng)計學(xué)意義。然而，所有結(jié)果與亞硫酸鹽單獨作用比較差異都有顯著性(P＜0.05 or 0.01)，表明了EGCG抑制了亞硫酸鹽誘導(dǎo)的自由基的產(chǎn)生。

3 討論

亞硫酸鹽可能通過食物、飲料和藥物等進入體內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生含硫的自由基或過氧自由基，對各種器官及組織包括心臟造成一定的氧化損傷［6-7］。低濃度的EGCG就能起到抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤及抗癌作用，且對正常細胞的功能無明顯的抑制作用。本研究主要探討了EGCG對心血管系統(tǒng)的保護是否是通過抗氧化途徑完成的。本研究結(jié)果表明，亞硫酸鹽抑制了SOD，CAT和GPx的活性。當(dāng)加入不同濃度的EGCG時，3種抗氧化酶的活性隨著其濃度的增加而回升。為了證明以上結(jié)論，本研究測定了心肌細胞內(nèi)的自由基水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽誘導(dǎo)了自由基的產(chǎn)生，而EGCG則抑制了這一作用。當(dāng)EGCG濃度為30 mg·L-1時，亞硫酸鹽的誘導(dǎo)作用不再明顯。研究表明，EGCG的水溶液能夠抑制脂質(zhì)過氧化，清除體內(nèi)的H2O2和自由基［8］，本研究結(jié)果與該觀點是一致的。

綜上所述，EGCG溶于水清除了體內(nèi)過多的活性氧自由基保護了多種抗氧化酶，對亞硫酸鹽誘導(dǎo)的心肌細胞的氧化損傷起到了一定的抑制作用。但有報道稱EGCG在實驗過程中存在自氧化現(xiàn)象，因此在今后的工作中還有待進一步研究。

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