GPR30在乳腺癌內(nèi)分泌治療耐受中的作用研究

朱克鵬 綜述 楊光倫 涂剛 審校

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，重慶 400016

內(nèi)分泌治療是乳腺癌患者綜 合治療的重要組成部分，他莫昔芬(tam oxifen，TAM)屬于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulator，SE RM)類藥物，是目前最基礎、有效，且運用歷史最悠久的一線內(nèi)分泌治療藥物，但一旦發(fā)生耐藥，TAM反而會促進腫瘤的生長。所以長期應用TAM的繼發(fā)性耐藥限制了其臨床應用。因此，研究內(nèi)分泌治療的耐藥機制，同時尋找克服治療耐藥的方法，進而開發(fā)相關抗耐藥藥物有著重要的臨床意義。

G蛋白偶聯(lián)受體-30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)是一種新型具有獨立作用的膜性結(jié)合性雌激素受體(estrogen receptor，ER)，介導表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和ER等重要信號轉(zhuǎn)導通路，參與乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為。GPR30的激活可能導致了TAM耐藥性的發(fā)生。本文從GPR30的作用機制和TAM的耐藥性機制聯(lián)系為出發(fā)點，探討GPR30在TAM耐藥性中的作用。

1 GPR30及其與EGFR、ERα的關系

1.1 GPR30的發(fā)現(xiàn)、功能及亞細胞定位

經(jīng)典理論認為，雌激素通過細胞內(nèi)兩種核受體ERα、ERβ調(diào)控轉(zhuǎn)錄反應，但二者并不足以完成雌激素的全部作用。GPR30為一類由375個氨基酸殘基組成的7 次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)，1997年Carmeci等［1］在不同細胞中克隆得到GPR30。2005年，Thomas等［2］和Revankar等［3］均證實其可特異性地與雌激素結(jié)合，與17β-estradiol(E2)的結(jié)合模式與經(jīng)典的ERα、ERβ均不同，且與二者沒有同源性，因此被視為一種具有獨立作用的新型ER。

GPR30與雌激素結(jié)合導致細胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移，cAMP增加，在細胞核內(nèi)合成三磷酸磷脂酰肌醇［phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate］。其參與介導了雌激素快速非基因組效應及基因組轉(zhuǎn)錄反應，促進細胞增殖和組織生長。GPR30可能參與抑制ERα(+)乳腺癌增殖［4］、SERM的耐藥過程［5］，并參與一些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷徙及轉(zhuǎn)移等。

GPR30的亞細胞定位存在爭議［6］。Thomas等［2］及Filardo等［7］認為GPR30在細胞膜上結(jié)合配體發(fā)揮相關病理生理作用。近來研究證實GPR30亦可能定位于細胞內(nèi)，Gβ、Gγ亞單位合成后定向轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)與Gα亞單位結(jié)合形成GPR30，在適當?shù)臈l件下，胞內(nèi)GPR30可能向細胞表面易位。研究者在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白(GFP)標記的GPR30主要聚集在乳腺癌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，同時發(fā)現(xiàn)，熒光標記的雌二醇(E2-Alexa 546和E2-Alexa 633)同GPR30-GFP共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，細胞膜外未發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點［3，8］。Funakoshi等［9］研究發(fā)現(xiàn)，GPR30位于HeLa細胞及海馬CA2錐體細胞的細胞膜，但在雌激素的作用下可以“轉(zhuǎn)位”到細胞質(zhì)。Cheng等［10］發(fā)現(xiàn)GPR30聚集于細胞核周圍。Madeo等［11］發(fā)現(xiàn)GPR30定位于細胞核內(nèi)，介導E2誘導乳腺癌相關蛋白(CAF)的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，目前多數(shù)學者認為GPR30是一種膜性結(jié)合性ER，然而較難定位GPR30位置及功能，因為其受細胞類型、細胞內(nèi)外因素影響［6］。

1.2 GPR30的生理與病理作用

E2、G-1、4-羥他莫昔芬(4-hydroxtamoxifen，OHT)及環(huán)境雌激素等配體與GPR30結(jié)合后可轉(zhuǎn)活EGFR、上調(diào)cAMP和Ca2+，激活相應信號轉(zhuǎn)導途徑，最終在各雌激素敏感器官產(chǎn)生細胞增殖等相關反應。Filardo等［12］通過免疫組織化學法檢測321例原發(fā)性乳腺癌患者的ER、PR和GPER，發(fā)現(xiàn)GPR30與ER共同表達的比例為43%，同時發(fā)現(xiàn)GPR30過表達與Her-2過表達、腫瘤大小及遠處轉(zhuǎn)移相關，提示其是乳腺癌生物學進展的指標之一。但Kuo等［13］在118例乳腺浸潤性導管癌中發(fā)現(xiàn)GPR30 mRNA的表達與Her-2并無相關性。且無論在基因或蛋白水平，GPR30的表達與患者的年齡及腫瘤的大小、分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴血管侵襲均無相關性，證實其不是影響患者生存率的一個獨立因子。Arias-Pulido等［14］在炎性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)GPR30的表達率為69%，而GPR30與ER的表達呈負相關，與PR、Her-2及EGFR的表達無相關性。GPR30與患者總生存率(overall survival，OS)或無病生存率(disease free survival，DFS)無關，然而GPR30、ER共表達可提高OS并輕微提高DFS，二者均不表達的患者OS和DFS較差,這與之前的結(jié)果相反［15-16］。Pandey等［17］研究發(fā)現(xiàn)GPR30結(jié)合E2、OHT可以使CTGF表達上調(diào)，促進乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。E2、OHT還可通過GPR30刺激甲狀腺、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌細胞增殖［18-20］。Quinn等［21］證實E2與氟為司瓊(ICI182780)均可通過GPR30，在整合蛋白(integrin)、Shc、Src樣激酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)參與下，增強纖維連接蛋白基質(zhì)組裝形成原纖維，促進細胞黏附、播撒和生存，提示ER拮抗劑可能通過GPR30促進腫瘤生長和浸潤。近來發(fā)現(xiàn)GPR30參與鎘誘導乳腺癌細胞增殖，揭示鎘與GPR30的結(jié)合位點及信號級聯(lián)過程中相關事件的研究正在進行中［22］。

1.3 GPR30與EGFR及ERα的關系

GPR30是獨立于ERα、ERβ的新型雌激素膜性受體，可通過反式激活EGFR，介導E2增殖效應，參與乳腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移行為［23］，并且TAM及代謝產(chǎn)物OHT是其激動劑，因此可能在TAM耐藥中發(fā)揮重要作用。大量研究認為GPR30的生物學效應與EGFR、MAPK/ERK、PI3K/AKT、cAMP等信號傳導途徑關系密切［6，23-27］，有著密切的互動聯(lián)系(cross-talk)或存在正反饋回路。Prossnitz等［24-25］證實，E2、OHT等配體與GPR30結(jié)合，使G蛋白異三聚體解體，Gβ、Gγ通過百日咳毒素敏感途徑激活Src磷酸化，后者激活細胞膜表面的MMP，導致肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)的釋放，HB-EGF作為EGFR的配體與EGFR結(jié)合，激活其下游信號通路，包括促分裂活化因子磷酸化蛋白激酶(MAPK)、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、PI3K，增加c-fos等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達，促進細胞增殖和延長細胞周期進展。Filardo等［26］研究發(fā)現(xiàn)在表達GPR30的乳腺癌MCF-7細胞系中雌激素可以級聯(lián)激活MAPK/ERK途徑。而在不表達GPR30的乳腺癌MDA-MB231細胞系則不能激活該途徑，但MDA-MB231細胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染GPR30 后可恢復該途徑激活，從而證實了GPR30介導MAPK/ERK信號途徑的重要性。Albanito等［27］在SKBR3乳腺癌細胞中證實EGF活化EGFR信號上調(diào)GPR30的表達，EGF激發(fā)了一個GPR30介導參與的正反饋環(huán)形通路，介導E2增殖效應，增強了EGFR信號作用。

在多種癌組織、胰腺、骨、睪丸及血管內(nèi)皮等組織細胞中，GPR30和ER有協(xié)同作用［28］。Albanito等［20］在ERα(+)BG-1卵巢癌細胞研究中發(fā)現(xiàn)，E2或G-1誘導c-fos表達，激發(fā)GPR30、ERα表達，活化ERK。抑制EGFR轉(zhuǎn)導途徑可抑制上述通路，提示GPR30/EGFR信號依賴ERα表達程度。認為GPR30和ERα運用同一條EGFR信號途徑，參與E2、G-1共同刺激卵巢癌細胞增殖生長。Huang等［29］用免疫組化證實在子宮癌肉瘤中，GPR30和ERβ協(xié)同過表達，在進展期疾病中二者表達水平增高。GPR30和ERβ表達與ERα及PR無相關性。Sirianni等［30］證實在鼠GC-1精原細胞中，E2、G-1均可激活ERK，上調(diào)c-fos的表達，促進細胞增殖，而ERα拮抗劑ICI、EGFR抑制劑、ERK抑制劑以及GPR30基因沉默都可消除相關效應，說明ERα、GPR30之間存在“交談”，通過EGFR/ERK/c-fos途徑介導上述反應。Gao等［31］發(fā)現(xiàn)GPR30抑制ERK1/2和ERα磷酸化信號，拮抗雌激素依賴性子宮的發(fā)育。

2 TAM的藥理作用機制及相關耐藥機制

2.1 TAM的藥理作用機制

TAM為非甾體類抗雌激素藥物，結(jié)構(gòu)與雌激素相似，存在Z型和E型兩個異構(gòu)體。TAM進入細胞內(nèi)，與ER競爭性結(jié)合，形成受體復合物，引起ER構(gòu)象改變，阻止雌激素活性的發(fā)揮，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。

然而，對TAM敏感的ER陽性患者在用藥過程中仍有1/3發(fā)生TAM耐藥。研究發(fā)現(xiàn)ER與Her-2信號通路之間的“交談”是TAM耐藥的一個重要原因［32］，但這并不能完全解釋TAM的耐藥性機制，近年來發(fā)現(xiàn)GPR30可能是引起TAM耐藥的另一始動因素。GPR30在TAM耐藥中的作用是當前研究熱點之一。

2.2 TAM的相關耐藥機制

對于不同的基因和細胞環(huán)境，TAM起著部分激動劑/拮抗劑或完全激動劑作用。TAM治療的乳腺癌細胞產(chǎn)生耐藥，實際是促進癌細胞的增殖。目前乳腺癌細胞在TAM治療過程中發(fā)生耐藥的生物學機制并不完全清楚，Riggins等［33］認為TAM的先天和獲得性耐藥與多種機制相關，主要包括：⑴與ERα的表達、下調(diào)，ERα突變，ER磷酸化有關；⑵與EGFR/ Her-2、ERK1/2、PI3K/AKT、IGF-1R等信號通路的活化有關；⑶與Cas、c-Scr、BCAR3等分子過表達有關。

相關研究證實，EGFR和(或)Her-2過表達，活化MAPK通路參與促進TAM耐藥性的產(chǎn)生［37］。ER與各生長因子信號通路之間的“交談”是TAM產(chǎn)生耐藥的另一個重要原因［35］。多種機制可下調(diào)ER途徑的各種成分，調(diào)節(jié)細胞周期，促進腫瘤增殖、分化，其中最重要的是EGFR/Her-2途徑［36］。Her-2在乳腺癌中的耐藥是通過激活顯性負抑制酪氨酸激酶(Akt)或MAPK完成的，這些激酶可以使ER磷酸化，Her-2與ER間的這種相互作用，可能導致乳腺癌細胞對TAM產(chǎn)生耐藥。Leary等［37］研究證實在內(nèi)分泌治療獲得耐藥的細胞模型中Her-2表達上調(diào)，而Her-2抑制劑拉帕替尼(lapatinib)可恢復內(nèi)分泌系統(tǒng)的敏感性，在經(jīng)TAM處理的ERα活性降低的細胞模型中，拉帕替尼可恢復ERα的基因活性功能，提高TAM療效，這種效應取決于ERα/Her-2的“交談”特點，提示ERα/Her-2可能在乳腺癌患者TAM耐藥中起重要作用。Creighton等［38］通過建立乳腺癌(MCF-7)體內(nèi)模型，揭示在TAM耐藥乳腺癌中，通過ER突變或生長因子信號途徑，一定程度上再活化雌激素信號途徑產(chǎn)生耐藥。上述細胞系活化EGFR及Her-2信號途徑產(chǎn)生耐藥。當運用Her-2抑制劑吉非替尼(gefitinib)和氟為司瓊時，發(fā)生TAM耐藥時間明顯推遲。TAM和吉非替尼可阻止Her-2途徑，恢復TAM的抗腫瘤效應。這提示EGFR/Her-2和ER信號通路在ER陽性乳腺癌患者TAM耐藥中起重要作用。

3 GPR30在TAM中的耐藥性機制

隨著對乳腺癌內(nèi)分泌治療研究的愈加深入，發(fā)現(xiàn)約30%的ER和PR陽性的患者對TAM治療不敏感或無效，這意味著阻斷ER相關信號通路并不能完全抑制癌細胞生長。E2、TAM及代謝產(chǎn)物OHT和ICI182780均能激活GPR30，OHT對ICI182780、ERα是完全或不完全的拮抗劑，而對GPR30則是激動劑，能促進GPR30反式激活EGFR信號途徑，從而導致上述藥物耐藥性的產(chǎn)生。

Ignatov等［39］第一次證實了GPR30在TAM-R乳腺癌細胞中的耐藥性機制。用TAM長期處理MCF-7細胞增強其對E2的敏感性，上調(diào)GPR30表達，使GPR30從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位至細胞表面，此時TAM被轉(zhuǎn)變成促生長激動劑。GPR30活化c-Src、MMPs，繼而激活EGFR信號，下游的MAPK和AKT磷酸化促進包括ER在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄和細胞增殖。而磷酸化的ER進一步上調(diào)GPR30，從而建立一個惡性循環(huán)周期，導致TAM耐藥性的產(chǎn)生。GPR30上調(diào)可增加TAM-R細胞對G-1的敏感性，并促進耐藥性的發(fā)展。經(jīng)G-1處理的MCF-7細胞，TAM增強MAPK磷酸化，當敲除GPR30，抑制EGFR信號時，可恢復TAM的生物效應。證實了GPR30 /MAPK信號串聯(lián)在體外TAM耐藥性形成中的重要作用。Mojarrad等［40］通過建立的細胞模型證實，自分泌人類生長激素(human growth hormone，HGH)上調(diào)GPR30的表達，增加細胞增殖，降低細胞凋亡，進而導致細胞TAM耐藥。Vivacqua等［41］揭示在TAM耐藥細胞中，EGF和TGFα活化EGFR/ERK信號通路，反式激活GPR30，上調(diào)mRNA、蛋白的表達。誘使c-fos結(jié)合活化蛋白1(activating protein 1，AP-1)位點，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性，參與細胞增殖、分化、侵襲和生存。GPR30與EGFR、ERα之間存在著豐富的互動聯(lián)系，導致TAM耐藥性的產(chǎn)生，最重要的是TAM能結(jié)合并活化GPR30。Kleuser等［42］認為E2和ICI182780均可通過GPR30抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β信號通路，導致乳腺癌患者內(nèi)分泌治療耐藥。Ignatov等［43］比較了95例接受TAM或其他輔助治療的乳腺癌患者子宮內(nèi)膜組織中GPR30的表達類型發(fā)現(xiàn)，在體外TAM通過GPR30刺激MAPK磷酸化和子宮內(nèi)膜細胞系的細胞增殖，在體內(nèi)GPR30表達水平與TAM誘導子宮內(nèi)膜病理相關，而且GPR30可預測疾病的早期發(fā)展癥狀并誘導TAM治療，從而證實GPR30在TAM誘導子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。Albanito等［20］認為GPR30與ERα在內(nèi)分泌治療耐藥和雌激素敏感性腫瘤的發(fā)展過程中，運用同一條EGFR信號通路。國內(nèi)外一些相關的耐藥性機制研究也正在實驗當中，相信隨著細胞和分子生物學技術(shù)的發(fā)展會更加全面的揭示GPR30在TAM耐藥性中的發(fā)生機制，作為新的靶向目標為開發(fā)預防和治療抗腫瘤藥物提供機遇［44-45］。

4 小結(jié)

盡管人類GPR30與鼠GPR30約有87%相似性，在功能和病理學上仍存在13%差異，GPR30具體是否是雌激素受體，體內(nèi)作用如何，能否結(jié)合雌二醇及其亞細胞定位均存在爭議。

我們認為利用G-1［46］、G-15［47］、E3［48］能進一步揭示體內(nèi)GPR30機制、細胞和生理及生物學功能等，開啟針對 GPR30相關疾病的診斷和治療。E2、OHT和ICI18278做為GPR30激動劑，對GPR30活化信號通路和誘使TAM產(chǎn)生耐藥的機制的深入研究，將為開發(fā)拮抗GPR30和經(jīng)典ER途徑的藥物提供新的平臺。

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