兩種脫鈣法植被鼠尾病理切片的比較

劉向云，朱正盛，孫祖越

（上海市計劃生育科學(xué)研究所藥理毒理室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心，上海 200032）

大鼠是常用的實驗動物，其應(yīng)用十分廣泛，在生物醫(yī)學(xué)研究中所用實驗動物中大鼠占20％以上［1］。大鼠尾靜脈注射給藥是動物實驗中常用的給藥途徑，為觀察大鼠尾巴注射局部的藥物反應(yīng)需制作尾巴標(biāo)本石蠟切片以供病理診斷。大鼠尾巴為周圍皮膚等軟組織環(huán)繞中心尾骨的結(jié)構(gòu)，作橫切片時若未脫鈣處理，則切片易斷裂破碎且切片刀磨損嚴(yán)重；若用硝酸脫鈣液處理，則易損害組織結(jié)構(gòu)，影響染色效果。我室采用鹽酸脫鈣液運用兩種脫鈣方法制作的大鼠尾巴標(biāo)本石蠟切片完整無破碎，HE染色效果較好，組織結(jié)構(gòu)未可見損壞?，F(xiàn)將制作方法介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料

標(biāo)本：取自SD大鼠（SD大鼠體重400～450 g，上海BK公司提供［SCXK（滬）2003-0002］。尾巴，橫切0.5 cm左右。

鹽酸脫鈣液：鹽酸8.5 m L、甲酸5 m L、無水三氯化鋁7 g，加入100 m L蒸餾水中［2］。

1.2 方法

A組：大鼠尾巴標(biāo)本以福爾馬林溶液充分固定后浸入鹽酸脫鈣液中脫鈣，脫鈣液早晚各更換一次，以針刺入尾骨無阻力感為脫鈣終點。脫鈣完成后流水沖洗1 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋直至切片、HE染色。

B組：大鼠尾巴標(biāo)本以福爾馬林溶液充分固定、流水沖洗后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。修切蠟塊，然后將蠟塊切面向下置于存有鹽酸脫鈣液的培養(yǎng)皿中。標(biāo)本脫鈣處理時應(yīng)在培養(yǎng)皿底部襯墊兩層濾紙，以避免蠟塊切面與培養(yǎng)皿底部粘連影響脫鈣液的浸潤。脫鈣3 h即可切出滿意切片，若需切片數(shù)量多可延長脫鈣時間。蠟塊脫鈣后流水沖洗30 min，常規(guī)切片、HE染色。

對照組：大鼠尾巴標(biāo)本不作脫鈣處理，常規(guī)制片。

2 結(jié)果

2.1 制片時間

A組完成脫鈣需要12～36 h（脫鈣時間與大鼠尾巴標(biāo)本直徑相關(guān)）；B組只需要數(shù)小時，制片周期大大縮短。

2.2 切片質(zhì)量

A、B兩組均能獲得厚薄均勻、完整無破碎的切片，且切片刀磨損較?。粚φ战M切片破碎斷裂、不完整，且切片刀磨損嚴(yán)重（封底圖1）。

2.3 染色效果

HE染色后鏡下觀察：組織結(jié)構(gòu)未見破壞，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核藍(lán)染、胞質(zhì)紅染，核漿分明，紅藍(lán)適度，A、B兩組切片染色效果無明顯差異；對照組組織破碎不完整，缺失較多，且有脫落的組織碎片沾染于切片上，組織重疊，著色深淺不一（封底圖2、圖3）。

3 討論

未經(jīng)脫鈣處理的尾巴標(biāo)本，其尾骨質(zhì)脆易碎，切片時破碎且牽拉周圍組織脫落而致切片破裂不完整、缺失較多，標(biāo)本無法觀察完全，易造成漏診；并且切片組織極易被脫落的碎片沾染，細(xì)胞重疊致使閱片時難以準(zhǔn)確診斷。這些都影響研究結(jié)論的準(zhǔn)確、可信。同時硬質(zhì)的尾骨對刀片有較大磨損，極易使刀片出現(xiàn)缺口，降低切片質(zhì)量。

大鼠尾巴標(biāo)本石蠟切片制作的關(guān)鍵在于脫鈣液的選擇。大鼠尾巴的組織結(jié)構(gòu)決定需要選擇既能迅速充分脫去尾骨鈣質(zhì)又不損害周圍皮膚等軟組織、影響HE染色效果的脫鈣液，同時由于尾骨被周圍軟組織包繞在內(nèi)，阻礙了脫鈣液與尾骨的接觸，遲緩鈣質(zhì)交換，延長脫鈣時間，脫鈣液的選擇更需慎重。硝酸脫鈣液脫鈣迅速但缺陷較大：脫鈣時間難以掌握易嚴(yán)重破壞組織細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)、脫鈣過程中產(chǎn)生二氧化碳分離結(jié)締組織造成組織不完整、易形成亞硝酸使組織黃染影響脫鈣速度且妨礙隨后的染色反應(yīng)、硝酸在脫鈣的同時酸化組織導(dǎo)致HE染色時細(xì)胞核著色欠佳造成染色效果不理想［3］。EDTA脫鈣液對組織無損傷，對組織抗原性的損傷也較小，但脫鈣速度緩慢，需數(shù)周才能脫鈣完畢［4］。本文所用的鹽酸脫鈣液性質(zhì)溫和，脫鈣速度快于EDTA脫鈣液。鹽酸脫鈣液中的甲酸脫鈣速度較硝酸緩慢，但對組織的破壞程度較輕，因而脫鈣時間范圍較廣，脫鈣完成后即使在脫鈣液中繼續(xù)存放1～2 d也不會破壞組織結(jié)構(gòu)。脫鈣液中的鹽酸成分可明顯增加脫鈣速度，它不會使組織膨脹，而是使組織略有收縮。無水三氯化鋁是保護劑，脫鈣液中的鋁離子易被吸附而起到保護作用，同時鋁離子又是常規(guī)HE染色蘇木精等色素的媒染助染劑［5］，可抵消鹽酸對細(xì)胞核著色的影響。胥維勇、楊群［6］報道此脫鈣液脫鈣處理標(biāo)本后可不經(jīng)中和及流水沖洗而直接進入脫水、透明、浸蠟和包埋等后續(xù)制作步驟。故而本文所用鹽酸脫鈣液脫鈣速度較快，脫鈣后染色效果較好，是理想的脫鈣液。

B組所用脫鈣方法是利用酸性溶液能夠穿透石蠟的特性，將常規(guī)包埋塊中的鈣化組織（如鈣化上皮瘤、甲狀腺瘤伴鈣化及肋骨組織等）與脫鈣液直接接觸進行快速脫鈣［7］。大鼠尾骨不是致密骨，骨質(zhì)較為疏松，適于此法進行快速脫鈣。此法脫鈣時間短，數(shù)小時即能切出高質(zhì)量的切片（尾巴直徑較粗者可適當(dāng)延長脫鈣時間），與A組相比較，制片周期大大縮短。用此法脫鈣，脫鈣液處理組織的時間很短，最大程度減輕了對組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，HE染色效果理想，能保證制片質(zhì)量。因此，推薦 B組脫鈣方法：修切蠟塊，然后將蠟塊切面向下置于存有鹽酸脫鈣液的培養(yǎng)皿中，再切片。

［1］胡建華，姚明，崔淑芳.實驗動物學(xué)教程［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2009：70.

［2］王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學(xué)技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：82.

［3］謝玲，鄒麗宜，張志平，等.改良脫鈣液制作脫鈣石蠟切片與傳統(tǒng)方法的比較［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（11）：2127.

［4］王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學(xué)技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：82.

［5］程敏，王穎，李保泉，等.改良的Gomori特殊染色在口腔硬組織切片中的應(yīng)用［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，24（2）；185 -186.

［6］胥維勇，楊群.脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應(yīng)用［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2002，11（3）：263.

［7］CFA·卡林.組織病理學(xué)與組織化學(xué)技術(shù)手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1982：61-71.