新鉑類藥物雙環(huán)鉑對8種結腸癌耐藥細胞的化療敏感性分析*

魏 雯,劉 楨,陳 曦,李楠靜,李立蘭,畢 鋒

(四川大學華西醫(yī)院腫瘤中心腹部腫瘤科,成都 610041)

雙環(huán)鉑是由北京興大科學系統(tǒng)公司開發(fā)的新型鉑類化合物,是我國具有完全自主知識產權的化學Ⅰ類抗癌新藥,體外研究和Ⅰ期臨床試驗顯示雙環(huán)鉑具有低毒、高效的抗腫瘤活性,是前景較好的新一代鉑類抗癌藥物[1-2]。本試驗選用雙環(huán)鉑作用于8種耐奧沙利鉑或伊立替康的結腸癌耐藥細胞系及其原代細胞,旨在測試雙環(huán)鉑對奧沙利鉑或伊立替康有無交叉耐藥性,及雙環(huán)鉑對耐藥結腸癌細胞的化療敏感性。為推廣雙環(huán)鉑的臨床應用,為耐藥患者提供更多的化療選擇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 選取由四川大學華西臨床醫(yī)學院信號轉導實驗室提供的8種結腸癌原代細胞及其耐藥細胞共配對成8組(耐奧沙利鉑和耐伊立替康各4組),所有耐藥細胞系均由本實驗室研究人員用濃度梯度遞增法誘導建立,經反復測試證明其耐藥性能穩(wěn)定[3],耐藥指數(RI=原代 IC50/耐藥IC50)為:COLO320和COLO320/OHP(10.16),COLO320和COLO320/CPT(25.87),SW620和SW620/OHP(21.06),SW620和SW620/CPT(19.38),SW480和SW480/OHP(12.19),SW480和SW480/CPT(14.13),LOVO和LOVO/OHP(13.78),LOVO和LOVO/CPT(15.56)。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司),新生小牛血清(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青公司),四甲基偶氮唑鹽(MT T,上海華舜生物工程有限公司),二甲基亞砜(DMSO,重慶醫(yī)藥股份有限公司化玻分公司),雙環(huán)鉑(北京市興大科學系統(tǒng)公司)。

1.3 方法 以原代細胞COLO320和耐藥細胞COLO320/OHP為例。

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將COLO320與COLO320/OHP細胞接種到含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃,5%CO2飽和濕度孵箱內培養(yǎng)(thermo),細胞呈單層貼壁生長。用0.1%胰酶消化傳代,以0.1 μ g/mL的奧沙利鉑維持其耐藥性。

1.3.2 接種細胞至培養(yǎng)板 將COLO320和COLO320/OHP用胰酶消化,離心后棄上清液,重懸為單細胞懸液,在細胞計數板上計數,得到細胞懸液濃度,稀釋至8 000～10 000個/mL,接種于96孔板上,每孔加100 μ L細胞懸液即800～1 000個細胞。

1.3.3 加藥培養(yǎng) 事先將雙環(huán)鉑用純水配置成從高到低的9個濃度:1 000、500、250、100、50、10、5、1、0.5 μ g/mL,在 96 孔板接種完成24 h后,再經新鮮培養(yǎng)基稀釋10倍使混合液中藥物終濃度為 100、50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μ g/mL,取一個上述接種好 COLO320與 COLO320/OHP細胞的 96孔板,按濃度從低到高的順序加入上述含藥培養(yǎng)基,每孔100 μ L。加藥后作用24 h再次更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),細胞在不同的濃度藥物作用之下出現(xiàn)生長差異,定期觀察細胞的生長狀況,并于更換培養(yǎng)基后48 h后做M TT細胞毒性試驗,將僅有細胞不加藥物的孔作為陰性對照。

1.3.4 M TT細胞毒性試驗 將上述換液培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)板棄掉原培養(yǎng)液,每孔加入100μ L培養(yǎng)基及20 μ L MT T避光孵育4 h,同時設置調零孔(培養(yǎng)基、MT T、二甲基亞砜),4 h后棄去孔中液體,加入 150 μ L DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm(570 nm)處測量各孔的吸光值(OD值),注意調零。

1.3.5 模擬臨床濃度計算抑制率 按照上述步驟另將耐藥細胞COLO320/OHP單獨培養(yǎng)于96孔板上,并根據公式藥物濃度(μ g/mL)=(1.75×D)/(5 000÷ 50%)×103(D 為臨床用藥劑量mg/m2,D值取450[2],1.75 m2為平均成人體表面積,5 000 mL為平均血容量,50%為血細胞比容,乘103后將mg換算成μ g,計算出雙環(huán)鉑的模擬臨床濃度為 78.75 μ g/mL,按該濃度將雙環(huán)鉑加入上述只含耐藥細胞的96孔板,并以未加藥的細胞做對照,重復MTT試驗。

1.3.6 統(tǒng)計學處理 所有數據均用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析,用回歸分析計算 COLO320與COLO320/OHP在雙環(huán)鉑作用下的IC50(半數致死濃度)[4-5]、耐藥指數,繪制抑制率曲線,并根據公式:抑制率=[(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白對照組平均OD值)]×100%,計算出雙環(huán)鉑在模擬臨床濃度為 78.75 μ g/mL時對8種結腸癌耐藥細胞的抑制率,從而間接反映其體外化療敏感性。剩余7個細胞組按照上述同樣的方法完成藥敏實驗(除COLO320及其耐藥細胞用胎牛培養(yǎng)基培養(yǎng)外,其余細胞均用小牛培養(yǎng)),每個濃度設3個復孔,每組細胞重復做3次。

2 結 果

各耐藥細胞系自身耐藥指數(對奧沙利鉑/伊立替康的耐藥指數)為10.16～25.87,而雙環(huán)鉑的耐藥指數均為 1.10～2.46,表明雙環(huán)鉑對耐奧沙利鉑、伊立替康細胞具有不完全交叉耐藥性。雙環(huán)鉑在模擬臨床用藥濃度下對8種結腸癌耐藥細胞中的7種敏感,對其中1種(480與480/CPT)細胞具有高度化療敏感性,3種(320與320/OHP、480與 480/OHP、LOVO與LOVO/OHP)中度敏感,3種(620與620/OHP、620與 620/CPT、LOVO與 LOVO/CPT)低度敏感,1種(320與 320/CPT)不敏感。見表1、圖1。

表1 雙環(huán)鉑對8種結腸癌耐藥細胞的化療敏感性

圖1 雙環(huán)鉑作用下各細胞系的耐藥指數與其原有耐藥指數的比較

3 討 論

20世紀60年代末,Rosenberg發(fā)現(xiàn)了第一個具有抗腫瘤活性的金屬配合物——順鉑[6],由此揭開了鉑類抗腫瘤藥物發(fā)展的序幕。順鉑在隨后的實驗中被證實具有抗癌譜廣泛、抗癌活性高、與其他類抗癌藥物少有交叉耐藥的優(yōu)點,因而被廣泛應用于臨床實體瘤的化療中[7],然而與此同時也發(fā)現(xiàn)其具有嚴重致惡心嘔吐和胃腸道毒性、腎毒性、骨髓抑制、耳毒性、周圍神經毒性等多種不良反應及易產生耐藥的缺點[8],限制了其臨床應用。于是,全世界的各個研究機構努力探尋一種既能保留較好的抗腫瘤活性,又能降低其不良反應及耐藥性的方法,并通過改造順鉑原有結構,至今已合成和篩選出鉑類化合物3 000多種[8]。其中第2代鉑類以卡鉑為代表,其抗癌譜和抗瘤活性與順鉑相似,可作為實體瘤治療中順鉑的替代藥物,腎毒性、消化道反應及神經毒性較順鉑為低,不需水化、利尿,使用方便[9]。第3代鉑類以奧沙利鉑為代表,對結直腸癌的治療取得突破性進展,與 5-FU、亞葉酸鈣聯(lián)用,對胃癌、非小細胞肺癌、卵巢癌也有較好療效。即便如此,腫瘤的耐藥及不可忽視的不良反應仍使這些鉑類藥物其不能發(fā)揮最大潛能[10-11]。

為了進一步研發(fā)低毒、高效、無耐藥的鉑類,在北京大學化學學院的楊旭清教授的帶領下,與多所重點高校及科研院所合作,成功研發(fā)了一種國家Ⅰ類抗腫瘤新藥雙環(huán)鉑。雙環(huán)鉑采用超分子的設計理論,使一系列性能優(yōu)于現(xiàn)已使用的鉑類抗癌藥,如在水中的溶解度、穩(wěn)定性和脂溶性[8].雙環(huán)鉑臨床前的研究和Ⅰ期、Ⅱ期臨床研究揭示,雙環(huán)鉑與老一代鉑類抗癌藥物相比,對各種惡性腫瘤有更好的效能和低的毒性[9,12-14],對腫瘤細胞有較好的靶向作用,且不良反應較小,能夠誘導部分腫瘤細胞凋亡[1,12,15-16]。在管忠震教授主持下,由中山大學腫瘤防治中心——國家抗腫瘤藥物臨床試驗研究中心完成了Ⅰ期臨床,證明本品安全性良好,其胃腸道反應及腎毒性低于順鉑,其血液毒性低于卡鉑。蛋白結合率低,消除半衰期長。該技術項目已獲得知識產權局的發(fā)明專利證書,并也獲得美國、歐盟、俄羅斯、日本、韓國等國家和地區(qū)的發(fā)明專利證書,得到知識產權保護(美國專利號:6699901B1,歐洲專利號:1186610,日本專利號:3697210)。目前正進入Ⅱ(Ⅲ)期臨床階段。新近公布的一個Ⅱ期臨床研究結果表明:雙環(huán)鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案和卡鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案相比,療效大致相仿,安全性良好,試驗組與對照組相比可能有一定的生存獲益,值得開展進一步臨床研究明確[2]。

本試驗通過測試雙環(huán)鉑對8種耐藥結腸癌細胞的化療敏感性,從而了解雙環(huán)鉑對現(xiàn)今一線抗結腸癌藥物奧沙利鉑及伊立替康有無交叉耐藥性,從而為臨床耐藥患者提供更多化療選擇奠定基礎。試驗技術主要采用了M TT細胞毒性試驗[4]。試驗結果表明:各耐藥細胞系自身耐藥指數(對奧沙利鉑/伊立替康的耐藥指數)為10.16～25.87,而雙環(huán)鉑的耐藥指數均為1.10～2.46,表明雙環(huán)鉑對耐奧沙利鉑、伊立替康細胞具有明顯化療殺傷作用,對奧、伊兩藥具有不完全交叉耐藥性。雙環(huán)鉑在模擬臨床用藥濃度下對8種結腸癌耐藥細胞中的7種敏感,對其中1種(480與480/CPT)細胞具有高度化療敏感性,3種(320與320/OHP、480與 480/OHP、LOVO 與 LOVO/OHP)中度敏感,3種(620與 620/OHP、620與 620/CPT、LOVO 與LOVO/CPT)低度敏感,1種(320與320/CPT)不敏感。

本試驗是將腫瘤細胞完全暴露在藥物下進行的,而藥物在體內分布、代謝、排泄速度與體外實驗具有較大差異。然而,體外藥敏實驗結果的初步篩選可為臨床治療提供線索。因此,在完善更多試驗來進一步證實其療效后,可考慮將雙環(huán)鉑作為耐奧沙利鉑和伊立替康患者的另一化療選擇。下一步將繼續(xù)完善:選取更多的耐藥細胞種類,進行多藥聯(lián)合化療敏感性測試,并進行動物試驗驗證療效,期待在不久的將來能為臨床患者帶來益處。

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