神經干細胞體外培養(yǎng)定向分化為多巴胺能神經元相關因子的研究

陳 立， 杜 娟， 呂曉紅

神經干細胞(neural stem cell，NSCs)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，并具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，存在于中樞神經系統多個部位。神經干細胞的最直接應用是利用神經干細胞的多方向分化潛能特性，進行神經干細胞的移植，以恢復宿主的中樞神經系統的正常結構和功能。由于細胞移植治療需要相當數量的移植源。因此，如何誘導神經干細胞向目的細胞如多巴胺能神經元分化則是問題的關鍵。目前研究表明，神經干細胞擬定向分化為多巴胺能神經元存在兩種機制，一種為內源性機制(由神經干細胞內在基因調控)，另一種為外源性機制，即通過體外給予化學誘導劑或細胞因子誘導。本文將對能夠使神經干細胞分化為多巴胺能神經元的相關因子綜述如下。

1 定向分化相關因子

1．1 膠質源性神經營養(yǎng)因子(Glial cell-derived neurotrophic factor GDNF) GDNF是1993年Lin等發(fā)現并克隆出來的，它是一種神經營養(yǎng)因子，是轉化生長因子家族中的一員。GDNF廣泛分布于中樞神經系統的的多巴胺能神經元區(qū)域，在腹側蒼白球、嗅結節(jié)、梨狀區(qū)等也有表達［1］。近年來，隨著神經干細胞的大量深入研究，GDNF在其中的作用越來越重要。GDNF不僅對多巴胺能神經元具有營養(yǎng)、支持、保護和修復作用，而且在神經干細胞分化為多巴胺能神經元中也起著重要作用。Eleni等［2］在培養(yǎng)胚胎中腦來源的神經干細胞時加入GDNF后發(fā)現神經球高度表達早期多巴胺能神經元特異性的基因Nurrl和pitx3，沒有加入GDNF的神經球則不表達。Yong等［3］在含有人類神經元祖細胞(human neural progenitor hNP)培養(yǎng)液中加入25ng/mlGDNF，培養(yǎng)21d，與對照組相比，GDNF組分化的表達TH陽性細胞比例達50%，而沒有加入GDNF的分化比例僅為2．9%(P＜0．05)，此外還能表達多巴胺能神經元受體 D1、D4和 D5。丁繼固等［4］在有血清條件下體外培養(yǎng)鼠胚中腦神經干細胞，予以GDNF作誘導分化，結果顯示GDNF可促進中腦神經干細胞向多巴胺能神經元分化。此外，沈峰等［5］在體外擴增GDNF基因，并構建帶有綠色熒光蛋白(GFP)的表達載體PcDNA3-GDNF-GFP質粒，并將其轉染神經干細胞，結果顯示轉染后72h熒光蛋白大量表達，該研究表明GDNF基因能明顯促進神經干細胞分化為多巴胺神經元的比例。研究表明，GDNF是通過其受體發(fā)揮作用的。GDNF受體是一種多成分協同受體，它是由GDNF受體＆(GFR＆)和Ret蛋白組成，GFR＆ 有4種亞型:GFR＆1、GFR＆2、GFR＆3和 GFR＆4。Ret是原癌基因表達產物，是受體酪氨酸激酶(Rtk)超家族成員，特異性配體與受體酪氨酸激酶結合后，激活其胞內部分，使其通過磷酸化、變構和易位與相應的胞內蛋白相結合，由不同的第二信使來傳導發(fā)揮作用［6］。

1．2 白細胞介素-1(Interleukin-1 IL-1) IL-1是單核細胞產生的多肽，腦內的多種神經元、血管內皮細胞、大小膠質細胞、巨噬細胞均可產生IL-1。白細胞介素1(包括IL-1α和IL-1β)作為一種重要誘導劑，參與神經系統多巴胺能神經元的發(fā)育，單獨或與一些細胞因子聯合使用可以誘導神經干細胞分化出較為典型的酪氨酸羥化酶陽性神經元，這些誘導的神經元用于移植治療帕金森病的6-羥基多巴胺模型大鼠療效顯著。有研究表明，人腦海馬區(qū)的神經纖維及大鼠大腦前皮質、海馬、嗅球、小腦脈絡叢、下丘腦紋狀體及延髓存在高密度的IL-1受體和IL-1β。劉兵等［7］利用IL-1α誘導小鼠胚胎中腦神經元干細胞，免疫組化鑒定結果顯示IL-α1能明顯提高神經干細胞分化為多巴胺能神經元的比例。另外，譚雪峰等［8］利用IL-1α、IL-11、LIF和GDNF聯合誘導人神經干細胞向多巴胺神經元分化，結果發(fā)現IL-1α具有誘導人神經干細胞向多巴胺神經元分化的作用，聯合應用IL-11，LIF和GDNF對人神經干細胞向成熟多巴胺神經元分化具有協同作用。劉兵、戴冀斌等［9］運用IL-1β對體外分離培養(yǎng)的小鼠胚胎中的中腦神經干細胞進行誘導分化，結果顯示多巴能神經元分化比例達16%左右。此外，丁繼固等［10］也有類似的研究。

1．3 抗壞血酸(Ascorbic Acid AA) 抗壞血酸(AA)是人體必需的水溶性維生素，缺乏會導致壞血病，同時作為一種誘導因子，AA在誘導神經干細胞向多巴胺能神經元方向分化也起著重要作用。沈岳飛等［11］利用不同濃度的AA誘導神經干細胞向多巴胺能神經元分化，結果顯示各濃度AA均能促進其向多巴胺能神經元分化。此外，對于不同來源的神經干細胞，AA的誘導作用也不同。彭超華等［12］用AA對皮質來源與中腦來源的神經干細胞進行分化，經誘導，中腦神經干細胞在AA的作用下均可分化出TH陽性細胞。另有研究表明，利用AA聯合GDNF誘導神經干細胞向多巴胺神經元分化，作用更明顯，細胞形態(tài)更成熟［13］。此外，韓姝等［14］研究不同培養(yǎng)條件下神經干細胞分化的比例，將神經干細胞分為4組，對照組(不加任何誘導因子組)、抗壞血酸誘導組(AA組)、Wnt3a(wingless Int 3a)重組腺病毒誘導組(Wnt3a組)，以及Wnt3a重組腺病毒加抗壞血酸誘導組(Wnt3a+AA組)。結果顯示，Wnt3a組細胞中的多巴胺能神經元前體細胞特異性標志Nurr1表達量顯著增多，Wnt3a+AA組多巴胺能神經元明顯多于AA組，酪氨酸羥化酶(TH)在mRNA水平上的表達是AA組的1．86倍．蛋白質印跡及免疫細胞化學染色顯示，各誘導組均有TH的表達，Wnt3a組和AA組多巴胺能神經元陽性細胞數比例分別為(5．76±3．34)% 和(37．42 ±2．54)%，與 Wnt3a+AA 組(73．96 ±2．61)% 比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。Jaroslaw等［15］將培養(yǎng)的人中腦神經干細胞置于低氧環(huán)境中，加入抗壞血酸及腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)并延長分化時間，結果可誘導出大量TH陽性神經元。

1．4 骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein BMP2)骨形成蛋白2(BMP2)是生長因子BMPs家族的重要成員，在神經發(fā)育的不同階段、不同部位發(fā)揮重要的調節(jié)作用。研究表明:BMP2在神經干細胞分化中起重要作用，不同濃度的BMP2在不同發(fā)育階段，不同部位來源的神經干細胞分化中有復雜的調控作用，BMP2誘導神經干細胞分化成不同的神經細胞。劉勝華等［16］利用BMP2對室管膜前下區(qū)神經干細胞(SVZa NSCs)進行誘導，觀察其分化為酪氨酸羥化酶陽性(TH+)神經元的情況，同時用RT-PCR檢測DLX5 mRNA(DLX5基因屬于轉錄因子基因，主要存在于細胞核，通過誘導其下游基因如TH基因轉錄，使其表達嗅球中間神經元如TH+中間神經元的表型特征最終定向分化為嗅球中間神經元如多巴胺神經元)表達水平，結果顯示 BMP2組 SVZa NSCs向TH+神經元分化的比例和DLX5 mRNA表達水平均顯著高于對照組，該研究表明BMP2可能通過上調DLX5表達水平從而促進SVZa NSCs向多巴胺能神經元分化。此外也有人研究了BMP2及星形膠質細胞條件培養(yǎng)液(ACM)誘導SVZa NSCs向多巴胺能神經元分化的情況，結果顯示BMP2及ACM均可誘導成功，其中BMP2+ACM組分化比例最高，推測與星形膠質細胞分泌的多種生物活性物質如:神經生長因子(Nerve Growth Factor NGF)、GDNF、BDNF等有關［17］。研究發(fā)現，BMP2的作用機制主要是與受體結合后激活Smad信號途徑，然后發(fā)揮其生物學效應［18，19］，而ACM中的GDNF主要是通過Ret激活酪氨酸激酶通路發(fā)揮作用［20］。還有人利用紋狀體提取液誘導中腦神經干細胞分化為多巴胺能神經元，經紋狀體提取液誘導后，能夠分化出多巴胺能神經元，分化比例達20%左右，推測與其中的細胞因子有關［21］。

1．5 Brn-4 Brn-4是POU(Pit-Oct-Unc)蛋白家族成員之一，POU同源域蛋白是一大類含POU結構域的轉錄因子家族。Brn-4在神經系統中大量表達，可參與神經細胞生長和分化。大量研究表明體外因子在促進神經元前體細胞分化過程中可上調Brn-4基因的表達，進一步研究發(fā)現:如果封閉Brn-4基因，導致分化的神經元數顯著下降［22，23］。譚雪峰等［24］曾研究Brn-4在神經干細胞分化為多巴胺能神經中的作用，已知，Nurr-1(nuclear recepter related factor 1)在多巴胺神經元的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，但最近的研究表明Nurr-1尚不足以使神經干細胞分化為成熟的多巴胺神經元，譚雪峰等聯合Nurr-1與Brn-4誘導神經干細胞分化為多巴胺能細胞，結果發(fā)現單獨加入Nurr-1的培養(yǎng)液誘導出少量TH陽性細胞，而聯合應用Nurr-1與Brn-4培養(yǎng)出大量TH陽性細胞，結果具有統計學意義(P＜0．01)．。施金洪等［25］在大鼠海馬神經干細胞培養(yǎng)液中加入 Brn-4，發(fā)現Brn-4在海馬神經干細胞向神經元分化過程中可能發(fā)揮重要作用。

2 定向分化的神經元在帕金森病中的應用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見神經系統變性疾病，主要病理變化是和黑質多巴胺能神經元缺失路易小體形成。PD的研究已有近200年的歷史，由于其病因及發(fā)病機制尚未徹底明了，治療上不能從根本上解決黑質多巴胺能神經元的丟失，只能通過多巴胺替代療法改善癥狀，但并不能阻止病情進展。神經干細胞的全能性和成體干細胞橫向分化的多潛能性為帕金森病的治療提供了新的思路和方法。移植多巴胺能神經元替代已經變性的神經元，恢復黑質紋狀體多巴胺系統的完整性并改善其功能，利用干細胞的營養(yǎng)保護作減少多巴胺神經元凋亡等，神經干細胞治療可能是帕金森病眾多治療方案中一項非常有前途的治療措施。Yu等［26］聯合利用堿性纖維母細胞生長因子、肝磷脂及層粘連蛋白培養(yǎng)大鼠神經干細胞，誘導出大量酪氨酸羥化酶陽性神經元，后移植到經過6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine 6-OHDA)處理的帕金森病模型鼠，4w后移植的神經細胞仍然存活。Mimura等［27］證實腦內多巴胺能神經元移植可以使帕金森動物模型的行為學得到改善。Clare等［28］將體外培養(yǎng)的大鼠腹側中腦神經干細胞導入Wnt5a基因后可有效分化為多巴胺能神經元，并很好的表達多巴胺能神經元的生物學特性，將其移植到帕金森大鼠的紋狀體內，結果發(fā)現可顯著改善帕金森大鼠的行為學癥狀，更為重要的是沒有發(fā)現腫瘤的形成。另有研究將取自大鼠海馬的神經干細胞導入神經營養(yǎng)因子-3基因(rNSC-NT3)，經誘導分化獲得大量多巴胺能神經元，再移植到經6-OHDA處理的的帕金森模型鼠的腹側被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)及內側前腦束(medial forebrain bundle，MFB)，結果證實可顯著改善帕金森大鼠的行為學癥狀，該結果也表明NSC-NT3有可能成為將來治療帕金森病的潛在移植源［29］。2005年 Takagi等［30］將取自猴的胚胎干細胞中加入成纖維細胞生成因子20(fibroblast growth factor 20 FGF20)及成纖維細胞生成因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)進行誘導分化，培養(yǎng)出大量多巴胺能神經元，后移植到經 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-pyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)處理的帕金森病模型猴，移植后性能鑒定試驗(Performance Evaluation Test PET)發(fā)現存活的移植細胞具有多巴胺神經元的功能，并顯著改善帕金森病模型猴的行為學癥狀。由于MPTP誘導產生的帕金森病模型非常接近人類帕金森病，因此實驗結果對于細胞移植應用于臨床具有高度的預測性［31］。Michel將從神經外科手術中獲得的皮質及皮質下腦組織成功分離并培養(yǎng)數月，獲得大量神經干細胞，經誘導分化，培養(yǎng)出大量多巴胺能神經元及γ-氨基丁酸能神經元，研究人員將其移植到帕金森病患者的大腦紋狀體內，應用帕金森病統一評分量表(Uinifid Parkinson’s Disease Rating Scale UPDRS)進行評估，結果顯示:術前服用治療帕金森藥物癥狀改善達81%，移植術后2年癥狀改善達83%，術后5年評分回歸基線。該實驗表明移植的神經元能長時間的改善帕金森病患者的癥狀，同時也證明神經干細胞移植治療帕金森病的前景是非常誘人的［32］。Piccini及 Lindball也有類似研究［33，34］。

3 問題與展望

神經干細胞的發(fā)現為神經系統疾病特別是神經系統變性疾病的治療帶來了新的希望，當前神經干細胞的發(fā)展技術日新月異，部分研究已經應用于臨床，NSCs移植治療PD也取得了一定的效果，隨著對NSCs研究的逐步深入，需要解決的問題也逐漸增多。例如:如何獲得用于移植的高純度NSCs?如何把細胞導入人腦中某些合適的部位?如何保證移植入腦內的NSCs只朝著目的細胞(如DA能神經元)分化而不分化為其它神經細胞(如神經膠質細胞)?為了在最短時間內達到治療效果，需要尋找?guī)追N不同的干細胞來源?綜上所述，神經干細胞研究前景誘人、潛力巨大，但是干細胞技術真正應用于臨床，還有很長的一段路要走。

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