王懷穎, 郝巖君, 張 悅, 辛海濤
自然衰老過程中人和嚙齒類動物出現(xiàn)認知功能下降,老年大鼠表現(xiàn)許多與海馬相關的空間記憶障礙。海馬神經(jīng)元信號轉導分子水平變化可影響學習記憶。核轉錄因子 cAMP反應元件結合蛋白(CREB)連結多條信號轉導途徑,參與多種生理功能調節(jié),是小鼠學習記憶形成的必須分子[1],衰老及多種神經(jīng)退行性疾病中可觀察到CREB信號通路異常[2]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠增齡過程中空間記憶功能改變與海馬CREB磷酸化水平有關[3]。銀杏葉片是從銀杏科植物銀杏樹葉中提取的天然植物藥,臨床常用于腦血管病治療,另外對衰老、癡呆、腦功能障礙也有一定改善作用,但確切機制尚不明確。本實驗以自然衰老大鼠為研究對象,通過補充外源銀杏葉片,觀察其對老年大鼠空間記憶及海馬CREB、pCREB表達影響,探討可能的藥理機制。
清潔級雄性Wistar大鼠由河北省實驗動物中心提供(合格證號804066)。試劑:CREB、p-CREB一抗、二抗,北京博奧森生物技術工程公司;β-actin一抗,Santa Cruz公司;化學發(fā)光試劑,河北博海生物工程公司。銀杏葉片,廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司。蛋白測定試劑盒,碧云天生物技術研究所。
1.2.1 動物分組 雄性Wistar大鼠分為青年對照組(3月齡)、老年對照組(13月齡)和銀杏葉組(13月齡)。銀杏葉組大鼠每日灌胃銀杏葉片250mg/kg,其余兩組動物每日灌胃等量蒸餾水,共8w。
1.2.2 Morris水迷宮實驗 BI-2000水迷宮跟蹤分析系統(tǒng),由不銹鋼圓形水池、一個可移動平臺和攝像系統(tǒng)組成,成都泰盟科技有限公司提供。
(1)定向航行試驗:測試大鼠學習能力。隨機選擇一個入水點,將大鼠背對平臺放入水中,攝像機記錄大鼠120s內(nèi)找到平臺時間,即逃避潛伏期。若大鼠找到平臺,平臺上停留15s。如果大鼠未在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺,將其引導到平臺,并停留15s,逃避潛伏期記為120s。每天上、下午各訓練1次,共4d。
(2)空間搜索實驗:考察大鼠記憶能力。第4天下午定向航行試驗結束后,撤去平臺,任選一個入水點將大鼠面朝池壁放入水中,記錄120s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)及平臺象限停留時間。
1.2.3 海馬蛋白提取 行為學實驗結束后腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物,斷頭取腦,冰臺上剝離海馬,-70℃低溫冰箱保存。取出低溫冰箱保存的海馬,加入適量組織裂解液于冰上研磨,4℃裂解30min,12000r/min離心 15min,取上清測定。BCA法測定組織勻漿液蛋白濃度。
1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白(每孔上樣量30μg),將蛋白轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,分別加入 CREB、p-CREB、β-actin 一抗,4℃過夜,加入二抗室溫孵育2h,加入ECL試劑反應,暗室發(fā)光,顯影定影。Quantity one圖像分析軟件分析數(shù)據(jù),以目的條帶與β-actin吸光度比值進行半定量分析。
見圖1。與青年對照組比較,老年對照組大鼠逃避潛伏期延長,具有顯著性差異(P<0.05)。銀杏葉組大鼠逃避潛伏期比老年對照組縮短,差異顯著(P<0.05)。第1天與其余3d比較,逃避潛伏期最長(P<0.05)。與第2天比較,第3天、第4天逃避潛伏期變短,有顯著差異(P<0.05)。第3天與第4天比較無顯著性差異。
圖1 不同組別大鼠逃避潛伏期
見表1。與青年對照組比較,老年對照組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)減少(P<0.05),平臺象限停留時間縮短(P<0.05)。銀杏葉組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)多于老年對照組大鼠,平臺象限停留時間比老年對照組大鼠延長,有顯著性差異(P<0.05)。
表1 大鼠空間搜索實驗結果(±s)
表1 大鼠空間搜索實驗結果(±s)
與年輕對照組比較*P<0.05;△與老齡對照組比較P<0.05
組別 動物只數(shù) 穿越平臺次數(shù) 平臺象限停留時間(s)年輕對照組老齡對照組銀杏葉組10 10 10 9.6 ±2.875 6.8 ±2.486*9.4 ±2.633△41.554 ±6.296 34.919 ±4.557*40.996 ±6.683△
見圖2。與青年對照組大鼠比較,老年對照組大鼠海馬CREB表達明顯下降(P<0.05);銀杏葉組大鼠海馬CREB表達水平升高,與老年對照組相比差異顯著(P<0.05)。老年對照組大鼠海馬p-CREB表達水平明顯低于青年對照組(P<0.05);與老年對照組比較,銀杏葉片組大鼠海馬p-CREB表達水平升高,有顯著性差異(P<0.05)。
圖2 銀杏葉片對衰老大鼠海馬CREB、pCREB表達的影響
空間學習記憶功能是大鼠腦功能重要組成部分,老齡大鼠可表現(xiàn)與海馬相關的空間記憶障礙。王蓉等以SD大鼠為研究對象,發(fā)現(xiàn)6月齡大鼠空間學習記憶能力最強,之后緩慢下降[4]。本實驗利用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶功能,發(fā)現(xiàn)老年Wistar大鼠逃避潛伏期延長,平臺象限停留時間縮短,穿越平臺次數(shù)減少,與年輕對照組相比差異顯著,說明老齡大鼠空間記憶功能降低。
CREB是一種組成型核轉錄因子,在各種激酶作用下,第133位Ser殘基磷酸化而活化,與DNA序列cAMP反應元件CRE結合,促進下游基因轉錄。多種基因啟動區(qū)包括CRE,如bcl-2、bdnf等,所以CREB信號轉導途徑下游表達產(chǎn)物參與調節(jié)細胞增殖與凋亡。當CREB作用被抑制后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少,LTP受損,基因表達改變[5]。p-CREB被認為是大鼠海馬空間記憶加工的分子標志物,大鼠空間學習過程中,cAMP-PKA-CERB信號傳遞途徑被激活,海馬p-CREB水平升高,促進空間記憶形成。增齡過程中,p-CREB水平降低導致小鼠空間記憶受損[3]。實驗結果顯示老年對照組大鼠海馬CREB、p-CREB水平均低于年輕對照組大鼠,可能影響空間記憶功能。
增齡過程中細胞氧化防御系統(tǒng)功能下降,造成氧化應激,導致衰老和多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)生[6]。研究發(fā)現(xiàn),抑制轉基因小鼠CREB信號傳遞途徑,造成死亡神經(jīng)元增多,氧化應激產(chǎn)物增多,說明CREB信號傳遞途徑可對抗氧化應激[7]。Ozqen等發(fā)現(xiàn)長期低水平H202刺激,造成心肌細胞CREB表達水平下降,影響該信號途徑[8]。
銀杏葉提取物主要成分是黃酮總甙和銀杏萜內(nèi)酯,能清除自由基,抑制細胞老化,對心、腦血管系統(tǒng)具有保護作用。小鼠補充EGb761后,可改善MPTP引起的神經(jīng)退行癥狀[9]。實驗中,服用銀杏葉提取物后,老齡大鼠穿越平臺次數(shù)和平臺象限停留時間均延長,空間記憶改善。而且銀杏葉組大鼠海馬CREB表達和活性升高,說明銀杏葉片可能通過上調大鼠海馬CREB表達及活性,促進長時程增強改善老齡大鼠空間記憶功能。
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