熒光偏振免疫法測(cè)定血中依替米星的濃度

毛 璐，卞 婧，張 威，甄健存 （北京積水潭醫(yī)院藥劑科，北京 100035）

硫酸依替米星系半合成氨基糖苷類抗生素，是我國(guó)自行研制的I類新藥，其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、抗交叉耐藥性好，且耳、腎毒性遠(yuǎn)低于其他氨基糖苷類抗生素，可以用于耐慶大霉素菌株，即產(chǎn)氨基糖苷類鈍化酶菌株的感染[1]。既往依替米星的血藥濃度測(cè)定采用微生物法，操作較為繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，而且患者不能同時(shí)使用其他抗菌藥物[2]，使用受到一定的局限性。近期有報(bào)道采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，但是生物樣本前處理較為繁瑣，提取后還需要進(jìn)行柱前衍生化，且回收率不高[3]，不能滿足日常臨床檢測(cè)的需要。熒光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）用于血藥濃度分析，適用于多種藥物的血藥濃度測(cè)定，具有測(cè)定速度快、操作方便、無(wú)需預(yù)處理樣品、取樣量少、測(cè)定精度和靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

1 儀器與試劑

熒光偏振免疫血藥濃度測(cè)定儀（TDx，美國(guó)Abbott公司），慶大霉素TDx檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Abbott公司，批號(hào)77404Q100），依替米星標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)130365-200301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

準(zhǔn)確稱取硫酸依替米星標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10 mL量瓶中，用磷酸鹽緩沖液配制成1000 μg·mL-1的濃溶液。

2.2 血清與緩沖液配制依替米星溶液濃度測(cè)定的等效性實(shí)驗(yàn)

取“2.1”中的濃溶液分別用空白血漿與磷酸鹽緩沖液配制成1 μg·mL-1的待測(cè)樣品，選用空白血清、磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照品。吸取待測(cè)品350 μL，平行測(cè)定5次，記錄檢測(cè)值，結(jié)果磷酸鹽緩沖液配制的依替米星測(cè)定值為（0.58±0.06），血漿濃度測(cè)定值為（0.56±0.07），經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，兩種配制方法無(wú)顯著性差異。因此，可以使用磷酸鹽緩沖液代替血清，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線及其他質(zhì)控點(diǎn)的配制。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取“2.1”中的濃溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋，配制成0.5，1.5，3.0，6.0，10，20 μg·mL-1的溶液。應(yīng)用TDx進(jìn)行測(cè)定，以依替米星濃度（X）為橫坐標(biāo)，實(shí)際響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)。最低檢測(cè)限為0.2 μg·mL-1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.439X+ 0.177 2，r=0.998 1，結(jié)果表明：在0.5～20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度考察

2.4.1 取“2.1”中的濃溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋，配制成1，8，16 μg·mL-1的溶液，應(yīng)用TDx進(jìn)行測(cè)定，于同日測(cè)定5次；之后將溶液于－24 ℃冷凍保存，每日融化后測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)量5 d，計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.30%，2.54%，1.23%；日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.73%，3.32%，1.79%。

2.4.2 取“2.1”中濃溶液用空白血清配制成1 μg·mL-1的溶液，于－24 ℃冷凍保存48 h，冷凍前及室溫融化后分別用TDx進(jìn)行測(cè)定，冷凍前、后的結(jié)果分別為（0.85±0.11）和（0.95±0.10），n=3，應(yīng)用t檢驗(yàn)，P=0.30，兩組數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異。

2.4.3 取“2.1”中的濃溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋，配制成1，8，16 μg·mL-1的溶液，應(yīng)用TDx進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定值代入回歸方程計(jì)算依替米星濃度，回收率=（測(cè)定平均值－空白值）/配制液的濃度×100%。結(jié)果：低、中、高三個(gè)濃度的回收率分別為（93.12±9.74）%，（102.41±2.73）%，（89.50±1.45）%。

3 討論

3.1 熒光偏振免疫測(cè)定法是利用熒光偏振及抗原、抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的免疫反應(yīng)原理進(jìn)行血藥濃度測(cè)定。熒光標(biāo)記的藥物與患者體液中的藥物共同競(jìng)爭(zhēng)抗體。依替米星與慶大霉素結(jié)構(gòu)相似，與慶大霉素的抗原抗體反應(yīng)有部分交叉，可與慶大霉素競(jìng)爭(zhēng)同一抗體，本次研究嘗試用市售的慶大霉素試劑盒進(jìn)行依替米星血藥濃度的檢測(cè)就是基于這一原理。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一推斷，但是測(cè)定值并非依替米星的實(shí)際濃度，需要公式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

3.2 本方法利用依替米星與慶大霉素結(jié)構(gòu)相似的原理進(jìn)行檢測(cè)，因此，慶大霉素以及與慶大霉素結(jié)構(gòu)相似的奈替米星和西索米星會(huì)干擾依替米星的測(cè)定。而其他結(jié)構(gòu)的藥物如阿米卡星、氨芐西林、紅霉素、萬(wàn)古霉素、頭孢類抗生素、喹諾酮類抗生素等對(duì)測(cè)定的影響均小于1%。臨床上對(duì)于難治感染，雖然會(huì)同時(shí)使用2種或2種以上抗生素，但將結(jié)構(gòu)相似的兩個(gè)氨基糖苷類藥物合用的可能性很少，因此對(duì)于絕大多數(shù)患者使用該方法測(cè)定依替米星濃度是可行的。在測(cè)定前應(yīng)該詢問(wèn)患者用藥史，如之前使用了慶大霉素、奈替米星及西索米星應(yīng)考慮到對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

3.3 氨基糖苷類抗生素的血藥濃度與療效、毒性反應(yīng)相關(guān)，有效血藥濃度窄，血藥濃度個(gè)體差異大，是非常需要進(jìn)行血藥濃度測(cè)定的一類藥物，也是抗生素中被監(jiān)測(cè)最多的藥物[4]，尤其是用于兒童[5]、老人、以及腎功能不全的患者時(shí)。依替米星血藥濃度測(cè)定中，既往使用的微生物法和高效液相色譜法很難滿足臨床上日常治療藥物監(jiān)測(cè)的要求，而FPIA法不需要預(yù)處理樣品，可直接進(jìn)樣檢測(cè)，樣品微量即可進(jìn)行檢測(cè)，而且可以檢測(cè)多種體液，如血漿、血清、尿、唾液、脊髓液、傷處和腎組織提取液等。應(yīng)用熒光偏振免疫法測(cè)定依替米星的血藥濃度，方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，可以用于臨床快速檢測(cè)依替米星的血藥濃度。同時(shí)，也可以進(jìn)一步了解該藥在體內(nèi)的代謝和分布規(guī)律，幫助患者個(gè)體化用藥，發(fā)揮藥物的療效，避免或減少毒性反應(yīng)，為臨床合理用藥提供重要依據(jù)。

[1] 王舒，高永良.氨基糖苷類藥物研究新進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(4)∶329-332.

[2] 吳抗美，陳吾法.微生物法測(cè)定硫酸依替米星血藥濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21(4)∶251-252.

[3] 郭巧珍，李培忠，關(guān)勇彪.高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿和腎臟中硫酸依替米星的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(3)∶247-248.

[4] 黃正明.關(guān)于治療藥物監(jiān)測(cè)和藥物不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)若干問(wèn)題的探討[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2005， 2(1)∶39-42.

[5] 丁俊杰，張智耀.兒科治療藥物監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2005， 2(2)∶34-36.