肥胖抑制素對大鼠胰腺腺泡和胰腺小葉淀粉酶分泌的影響

孫學(xué)成 廖專 李兆申

·論著·

肥胖抑制素對大鼠胰腺腺泡和胰腺小葉淀粉酶分泌的影響

孫學(xué)成 廖專 李兆申

目的研究不同劑量肥胖抑制素(Obestatin)對大鼠離體胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌的影響。方法體外分離大鼠胰腺腺泡，與不同濃度Obestatin (0、0.1、1、10、30 nmol/L)共培養(yǎng)1 h；另一組加Obestatin 30 min后加入100 pmol/L的膽囊收縮素(CCK-8)繼續(xù)培養(yǎng)30 min。分離含有胰腺內(nèi)神經(jīng)末端、胰島細胞及外分泌細胞的胰腺小葉，與不同濃度Obestatin共培養(yǎng)30 min；另一組加Obestatin同時加75 mmol/L KCl共培養(yǎng)30 min。測定培養(yǎng)液及細胞或胰腺小葉組織內(nèi)淀粉酶含量，計算淀粉酶分泌率。結(jié)果0、0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin不影響胰腺腺泡細胞淀粉酶分泌率[(3.48±1.44)%、(3.70±1.39)%、(3.36±1.24)%、(3.86±1.41)%、(4.54±2.01)%]。CCK-8能顯著刺激腺泡細胞的淀粉酶分泌率[(13.84±2.63)%比(3.48±1.44)%，P<0.05]，但0.1、1、10 nmol/L Obestatin對CCK-8誘導(dǎo)的胰腺腺泡淀粉酶分泌無顯著性影響[(14.55±1.70)%、(13.79±1.81)%、(14.39±1.12)%]。Obestatin(0.1、1、10、30 nmol/L)不影響胰腺小葉淀粉酶分泌率。KCl可顯著刺激胰腺小葉淀粉酶分泌率[為對照組的(1.84±0.29)倍，P<0.05]，但Obestatin對KCl誘導(dǎo)的胰腺小葉淀粉酶分泌無顯著影響[為對照組的(2.01±0.30)、(1.89±0.41)、(1.74±0.14)、(1.88±0.33)倍]。結(jié)論Obestatin對體外培養(yǎng)的大鼠胰腺腺泡細胞及胰腺小葉淀粉酶分泌率無顯著影響，也不能阻斷或協(xié)同CCK-8和KCl對胰腺淀粉酶分泌的促進作用。

胰腺； 肥胖抑制素； 胰腺腺泡； 淀粉酶； 膽囊收縮素

肥胖抑制素(Obestatin)是從胃組織內(nèi)提取的由23個氨基酸組成的腦腸肽，它與孤兒G蛋白GPR39受體結(jié)合，產(chǎn)生與食欲刺激素(Ghrelin)相拮抗的生理作用[1]。但也有研究得出不同的結(jié)果[2-3]。本研究應(yīng)用不同劑量的Obestatin與體外分離的大鼠胰腺腺泡、胰腺小葉共同培養(yǎng)，并給予膽囊收縮素(CCK-8)或KCl刺激，觀察細胞內(nèi)和細胞外淀粉酶分泌的變化，為研究Obestatin對胰腺分泌功能的影響提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、胰腺腺泡和胰腺小葉制備

健康雄性SD大鼠，清潔級， 2～3個月齡，體重200～250 g，購自第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗前禁食12 h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，在無菌條件下取出大鼠胰腺。

參照Williams等[4]方法制備胰腺腺泡。將胰腺置入10 ml新鮮配制的KRB緩沖液(127 mmol/L NaCl,1.28 mmol/L CaCl2,0.55 mmol/L MgCl2,4.7 mmol/L KCl,0.55 mmol/L Na2HPO4,10 mmol/L Hepes,11 mmol/L glucose,2 mmol/L glutamine,1% Eagele′s, 0.1 mg/ml大豆胰酶抑制劑，10 mg/ml胎牛血清，pH 7.4)中剔除脂肪和淋巴組織。將5 ml(0.3 mg/ml)的膠原酶溶液分點注入到胰腺間質(zhì)中，5 min后將胰腺組織剪成0.5～2 mm大小，移至無菌培養(yǎng)瓶中，充入100%氧氣，37℃震蕩水浴中消化50 min，加入4%胎牛血清，無針頭注射器輕輕吹打，150 μm尼龍篩網(wǎng)過濾，所得細胞于常溫下50 g離心3 min，用HRB溶液再懸浮細胞，充入100%氧氣后于37℃孵育30 min，獲取的細胞行HE染色和亞甲藍染色鑒定，腺泡細胞活性率>90%。

參照Scheele和Palade[5]方法提取胰腺小葉。將胰腺放入KHB溶液(110 mmol/L NaCl, 1.8 mmol/L CaCl2, 1.1 mmol/L MgCl2,4.7 mmol/L KCl, 1.1 mmol/L Na2HPO4, 25 mmol/L NaHCO3,25 mmol/L Hepes,11 mmol/L glucose, 2 mmol/L glutamine,0.1 mg/ml大豆胰酶抑制劑，1% Eagele′s，pH 7.4)中剔除脂肪和淋巴組織，沿胰腺間質(zhì)將胰腺剪成大小4 mm×5 mm小葉單位，KHB洗滌后移入培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶加入4.5 ml培養(yǎng)液和3個胰腺小葉，充入100%氧氣，37℃下孵育30 min恢復(fù)小葉功能。

二、實驗分組

用HRB溶液將腺泡細胞調(diào)至105/ml密度，取0.9 ml加入培養(yǎng)皿中，共9個培養(yǎng)皿。4個培養(yǎng)皿分別加入1 ml終濃度分別為0、0.1、1、10、30 nmol/L的 Obestatin(Phoenix Pharmaceuticals公司)培養(yǎng)1 h。另4個培養(yǎng)皿分別加入1 ml終濃度分別為0、0.1、1、10 nmol/L的Obestatin培養(yǎng)30 min，再加入100 pmol/L的CCK-8(北京康肽生物有限公司)繼續(xù)培養(yǎng)30 min。實驗重復(fù)2次。

將0.5 ml Obestatin分別加入10只裝有胰腺小葉的培養(yǎng)瓶(終濃度分別為 0、0.1、1、10、30 nmol/L)，每個濃度2只培養(yǎng)瓶，其中之一同時加入75 mmol/L的KCl培養(yǎng)30 min。實驗重復(fù)4次。

三、淀粉酶分泌率測定

將腺泡細胞懸液50 g離心3 min，取上清液100 μl，應(yīng)用日本HITACHI-7150自動生化分析儀測定淀粉酶活性。沉淀的腺泡細胞加入1 ml HRB，超聲破碎5 min，離心后取等量100 μl上清液測定細胞內(nèi)淀粉酶活性。淀粉酶分泌率(%)=上清淀粉酶/(細胞內(nèi)淀粉酶+上清淀粉酶)×100%。

取胰腺小葉培養(yǎng)上清液100 μl測定淀粉酶活性，棄上清后的胰腺小葉加1 ml KHB溶液，超聲破碎后離心取上清，稀釋10倍，測定淀粉酶活性。同法計算淀粉酶分泌率，結(jié)果以藥物處理組與對照組的倍數(shù)表示。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺腺泡細胞淀粉酶分泌率

對照組腺泡細胞的淀粉酶分泌率為(3.48±1.44)%，與0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin共培養(yǎng)1 h后，細胞淀粉酶分泌率分別為(3.70±1.39)%、(3.36±1.24)%、(3.86±1.41)%、(4.54±2.01)%，無明顯增高(P>0.05)。腺泡細胞與CCK-8共培養(yǎng)后，細胞淀粉酶分泌率明顯升高至(13.84±2.63)%(P<0.05)，加入0.1、1、10 nmol/L Obestatin培養(yǎng)1 h后，淀粉酶分泌率為(14.55±1.70)%、(13.79±1.81)%、(14.39±1.12)%，均顯著高于不加CCK-8的藥物組(P<0.05)，而與單加CCK-8組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

二、胰腺小葉淀粉酶分泌率

0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin與胰腺小葉共育30 min后，淀粉酶分泌率分別為對照組的(1.11±0.23)、(1.03±0.35)、(0.96±0.26)、(0.98±0.17)倍，無明顯增高。應(yīng)用75 mmol/L KCl刺激后，胰腺小葉淀粉酶分泌率明顯升高至對照組的(1.84±0.29)倍(P<0.05)，但加入0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin培養(yǎng)1 h后，淀粉酶分泌率分別為對照組的(2.01±0.30)、(1.89±0.41)、(1.74±0.14)、(1.88±0.33)倍，均顯著高于對照組(P<0.05)，但與單加KCl組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

Zizzari等[6]報道，外源性O(shè)bestatin腹腔注射后呈時間和劑量依賴性地抑制小鼠攝食量；腦室注射可以減少小鼠攝食量，抑制體重增加，抑制胃排空，減少空腸平滑肌收縮力，拮抗Ghrelin的刺激效應(yīng)。但也有報道Obestatin對攝食量、體重、胃排空均無影響[7]。胰腺外分泌受到包括腦腸肽在內(nèi)的體液和神經(jīng)等多個因素的調(diào)節(jié)，已有的研究表明，CCK、胰泌素、胰多肽(PP)等可以通過迷走神經(jīng)或直接的方式刺激胰腺外分泌，而神經(jīng)肽Y和生長抑素可以抑制胰腺外分泌。Kapica等[8]報道，經(jīng)十二指腸和靜脈分次給予Obestatin可以劑量依賴性地通過迷走神經(jīng)刺激胰蛋白酶分泌，但對胰液分泌量無影響。我們前期實驗也顯示，小劑量Obestatin連續(xù)靜脈給藥對大鼠胰腺外分泌并無影響。

胰腺腺泡細胞可分泌蛋白質(zhì)、淀粉酶和脂肪酶，因此單位時間內(nèi)淀粉酶含量的變化可以反映胰液外分泌的變化。由于大鼠自身Obestatin分泌存在晝夜節(jié)律性，并且受多因素影響，所以本實驗嚴格控制動物飼養(yǎng)條件，統(tǒng)一實驗時間，并采用重復(fù)實驗的方法控制誤差。結(jié)果顯示，不同劑量的Obestatin對胰腺腺泡和胰腺小葉的淀粉酶分泌無影響；CCK-8可刺激胰腺腺泡淀粉酶，KCl可刺激胰腺小葉淀粉酶分泌，但Obestatin不能阻斷或協(xié)同CCK-8和KCl對胰腺淀粉酶的促分泌作用，與Moechars等[9]的研究結(jié)果一致。由于胰腺外分泌受到復(fù)雜的神經(jīng)體液網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，多因素、多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)使我們的體外實驗有一定局限性。另外生理條件下體內(nèi)Obestatin以pmol為單位，而本實驗應(yīng)用nmol，因此需要進一步的實驗來進行驗證。

[1] Zhang JV, Ren PG, Avsian-Kretchmer O, et al. Obestatin, a peptide encoded by the ghrelin gene, opposes ghrelin′s effects on food intake. Science,2005,310:996-999.

[2] De Smet B，Thijs T，Peeters TL，et al．Effect of peripheral obestatin on gastric emptying and intestinal contractility in rodents．Neurogastroenterol Motil， 2007,19：211-217.

[3] Depoortere I，Thijs T，Moechars D，et al．Effect of peripheral obestatin on food intake and gastric emptying in ghrelin-knockout mice．Br J Pharmacol, 2008,153：1550-1557.

[4] Williams JA, Lee M. Microtubules and pancreatic amylase release by mouse pancreas in vitro. J Cell Biol,1976,71:795-806.

[5] Scheele GA, Palade GE, Tartakoff AM.Cell fractionation studies on the guinea pig pancreas. Redistribution of exocrine proteins during tissue homogenization.J Cell Biol,1978,78:110-130.

[6] Zizzari P，Longchamps R, Epelbaum J，et al．obestatin partially affects ghrelin stimulation of food intake and growth hormone secretion in rodents．Endocrinology,2007,148：1648-1653.

[7] Tremblay F，Perreault M，Klaman LD，et al．Normal food intake and body weight in mice lacking the G protein-coupled receptor GPR39．Endocrinology,2007,148：501-506.

[8] Kapica M, Zabielska M, Puzio I,et al.Obestatin stimulates the secretion of pancreatic juice enzymes through a vagal pathway in anaesthetized rats-preliminary results.J Physiol Pharmacol, 2007,58:123-130.

[9] Moechars D，Depoortere I，Moreaux B，et al．Altered gastro-intestinal and metabolic function in the GPR39-obestatin receptor-knockout mouse． Gastroenterology，2006，131：1131-1141．

2011-01-11)

(本文編輯：屠振興)

Effectsofobestatinonamylasereleaseofpancreaticacinarcellsandlobulesofrats

SUNXue-cheng,LIAOZhuan,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIAOZhuan,LIZhao-shen,Email：Liaozhuan@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effects of different doses of obestatin on amylase secretion of pancreatic acinar and lobules of rats in vitro.MethodsPancreatic acinar cells of rats were separated in vitro and incubated with different doses of obestatin (0, 0.1 ,1,10, 30 nmol/L) for 1h, another group of pancreatic acinar cells was incubated with obestatin for 30 min, then was incubated with 100 pmol/L CCK-8 for another 30 min. Pancreatic lobules, which containing intrapancreatic nerve terminals and islets, were prepared and were incubated with different concentrations of obestatin for 30 min at 37℃ with or without 75 mmol/L KCl. Amylase levels in the supernatants, acinar cells and pancreatic lobules were calculated as a percentage of total amylase content.ResultsObestatin (0, 0.1, 1, 10, 30 nmol/L) produced no significant change in basal amylase release of acinar cells[(3.48±1.44)%, (3.70±1.39)%, (3.36±1.24)%, (3.86±1.41)%, (4.54±2.01)%]. CCK-8 significantly increased amylase release of acinar cells[(13.84±2.63)%vs(3.48±1.44)%,P<0.05],but obestatin (0.1, 1, 10 nmol/L) has no effect on the amylase release induced by CCK-8 [(14.55±1.7)%, (13.79±1.81)%, (14.39±1.12)%]. Obestatin (0.1, 1, 10, 30 nmol/L) did not affect the amylase release of pancreatic lobule. KCl significantly increased amylase release, which was (1.84±0.29) folds higher than that of control group (P<0.05), but obestatin has no effect on the amylase release induced by KCl, which were (2.01±0.30), (1.89±0.41), (1.74±0.14), (1.88±0.33) folds higher than those of control group.ConclusionsExogenous obestatin has no effects on pancreatic exocrine of acinar cells and lobules of rats in vitro and cannot block or assist the increased amylase release induced by CCK-8 or KCl.

Pancreas; Obestatin； Pancreatic acinar； Amylase； Cholecystokinin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.013

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(30800510)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化科(孫學(xué)成、廖專、李兆申)；溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科(孫學(xué)成)

廖專，李兆申，Email：Liaozhuan@hotmail.com