結(jié)核分枝桿菌的休眠機(jī)制研究進(jìn)展

姚楠 張萬(wàn)江

結(jié)核病是長(zhǎng)期危害人類健康的嚴(yán)重傳染病之一，全球每年因肺結(jié)核死亡的患者超出300萬(wàn)例之多。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，現(xiàn)有結(jié)核病患者約500萬(wàn)例，僅次于印度，居世界第2位。據(jù)WHO估算全球有近1／3的人群感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），而其中僅10%發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，大多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲腥?，此時(shí)Mtb多以休眠菌形式存在［1］。但近年來(lái)由于人口增加、流動(dòng)人口增多、耐藥Mtb增多、農(nóng)村醫(yī)療條件差，以及個(gè)體免疫力低下等原因使活動(dòng)性結(jié)核病的比率大幅度提高，故研究結(jié)核發(fā)病機(jī)制的分子基礎(chǔ)至關(guān)重要。

Mtb的休眠狀態(tài)

Mtb的休眠狀態(tài)是指Mtb可以在體內(nèi)形成一種持續(xù)存在的狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，細(xì)菌生長(zhǎng)極為緩慢，細(xì)菌的酶活性降低從而使細(xì)菌的代謝路徑改變，同時(shí)蛋白合成改變，總蛋白的合成減少，細(xì)胞壁增厚，出現(xiàn)大量的16kD小熱休克蛋白［2］。

McCune等［3］于20世紀(jì)50年代首先提出結(jié)核休眠菌（dormant tubercle bacilli）的概念，在其設(shè)計(jì)的Cornell模型中用大劑量Mtb毒株感染小鼠，疾病自然進(jìn)展2周，然后用異煙肼（INH）和吡嗪酰胺（PZA）聯(lián)合化療12周后，取小鼠的肺和脾臟組織培養(yǎng)無(wú)Mtb生長(zhǎng)。倘若不給予進(jìn)一步治療，間隔一段時(shí)間可見(jiàn)Mtb又重新出現(xiàn)在這些組織，由此McCune等認(rèn)為這些組織中可能存在休眠狀態(tài)的Mtb。Wayne等［4］于1994年提出結(jié)核休眠菌是殘存在人體單核巨噬細(xì)胞內(nèi)極微量，處于代謝靜止期的Mtb。這些休眠菌可在體內(nèi)持續(xù)存在數(shù)月至數(shù)年而機(jī)體沒(méi)有不適或臨床癥狀，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)結(jié)核休眠菌又開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致疾病發(fā)生，出現(xiàn)臨床癥狀，這是近年來(lái)結(jié)核病發(fā)病率回升的主要因素之一。

在Wayne等［4］制作的體外“休眠”模型中，Mtb在氧氣缺乏的情況下形成了一種厭氧、耐藥和不能復(fù)制的狀態(tài)，認(rèn)為生長(zhǎng)繁殖期Mtb向休眠期Mtb轉(zhuǎn)變過(guò)程中可能存在某些酶的改變，使其代謝模式向乙醛酸旁路或其他旁路轉(zhuǎn)變，從而適應(yīng)休眠狀態(tài)。感染機(jī)體的Mtb可能有處于休眠狀態(tài)，因此休眠狀態(tài)Mtb在人體內(nèi)是普遍存在的。

Mtb休眠機(jī)制及相關(guān)因素

一、Mtb休眠生物學(xué)機(jī)制

隨著人們對(duì)潛伏感染的認(rèn)識(shí)，休眠期Mtb表達(dá)的抗原物質(zhì)開(kāi)始受到重視。體內(nèi)潛伏感染Mtb可通過(guò)改變基因或蛋白的表達(dá)而適應(yīng)不同的外部環(huán)境，從而在Mtb感染的不同階段產(chǎn)生相應(yīng)的不同的抗體［5］。休眠期 Mtb為了適應(yīng)缺氧等惡劣生存環(huán)境，使得部分基因表達(dá)上調(diào)。Mtb還通過(guò)抑制Ca2＋依賴性Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphoinositide 3－kinase，PI3K）：hVps34p級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制吞噬體成熟，從而利于其寄生胞內(nèi)［6］。在低氧和NO作用的環(huán)境中，休眠相關(guān)DosR調(diào)節(jié)子（包括48個(gè)基因）和HspX（Q－crystallin）基因表達(dá)上調(diào)［7］，部分上調(diào)表達(dá)的因子有抗原性［8］。其中，HspX抗原可以被致敏的T細(xì)胞識(shí)別，刺激T細(xì)胞分泌γ干擾素（IFN－γ），具有細(xì)胞免疫和體液免疫原性［8］。目前比較明確的與Mtb休眠有關(guān)的抗原包括小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）Hspl6.3、阿拉伯－甘露醇聚糖脂（lipoarabinomnnan，LAM）和異檸檬酸裂解酶（Isocitrate Lyase，ICL）［5］。

二、Mtb休眠與“泡沫”巨噬細(xì)胞（“foamy”macrophage）

泡沫細(xì)胞是由于多種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚集形成的，主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞［9］。近期有休眠模型研究表明，“泡沫”巨噬細(xì)胞的形成可能是 Mtb感染持續(xù)性的關(guān)鍵［10］，該模型在體外模擬人類免疫反應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Mtb可引導(dǎo)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)型為“泡沫”細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為“泡沫”細(xì)胞的巨噬細(xì)胞會(huì)喪失殺菌能力，轉(zhuǎn)型為一種非攻擊型狀態(tài)，且在細(xì)胞內(nèi)累積大量的脂質(zhì)，Mtb借此逃避宿主的免疫攻擊同時(shí)獲得大量的營(yíng)養(yǎng)成分。Mtb在這些細(xì)胞可持續(xù)存活，隨后進(jìn)入休眠狀態(tài)。

三、Mtb相關(guān)蛋白

（一）小分子熱休克蛋白（Hsp16.3）

Mtb小分子熱休克蛋白Hsp16.3是近年研究發(fā)現(xiàn)的存在于Mtb膜上的一個(gè)主要抗原蛋白，由144個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為16.277kD，等電點(diǎn)為4.85，序列分析表明它屬于sHsps家族［11-13］。有研究表明，Hsp16.3 可能與Mtb潛伏感染中體眠菌的形成有關(guān)［14］，該蛋白具有人和鼠的T細(xì)胞識(shí)別表位，并能誘導(dǎo)一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可能是Mtb潛伏性感染時(shí)的靶抗原［15］。

同時(shí)，Mtb進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞時(shí)可大量表達(dá)Hsp16.3，對(duì)其在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期生長(zhǎng)、繁殖和致病性都起重要作用［11］。Cunningham等［16］用轉(zhuǎn)換電鏡觀察到無(wú)氧條件下的Mtb休眠菌細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，同時(shí)用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）法測(cè)得休眠狀態(tài)下16kD小分子熱休克蛋白高度表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白與細(xì)胞壁增厚以及纖維肽多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)，認(rèn)為細(xì)胞壁增厚和16kD小分子熱休克蛋白的高度表達(dá)是Mtb能以休眠狀態(tài)長(zhǎng)期存在的主要原因。當(dāng)Mtb在體內(nèi)進(jìn)入巨噬細(xì)胞或在厭氧環(huán)境培養(yǎng)時(shí)，存在于細(xì)胞質(zhì)膜上的主要抗原Hsp 16.3會(huì)迅速大量表達(dá)，最多可達(dá)到整個(gè)菌體蛋白的25%，Mtb細(xì)胞壁增厚，以適應(yīng)長(zhǎng)期潛伏生長(zhǎng)的需要［16］。

另有研究表明，Hsp16.3不僅有助于 Mtb細(xì)胞膜的增厚，以及增強(qiáng)Mtb抵抗脅迫環(huán)境的能力，如NO、氧自由基、缺氧等不利因素的影響等，而且同時(shí)可以使Mtb在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止，有助于Mtb在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)滯留，長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖［17］。

（二）LAM

LAM是一種非蛋白 Mtb抗原，屬多糖，具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激Mtb感染者產(chǎn)生抗體。有文獻(xiàn)報(bào)道，Mtb感染宿主細(xì)胞后可引起絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路、PI3K／Akt通路和連接蛋白－信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（just another kinase，JAK）／（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路等多條相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活或抑制［18］。人體細(xì)胞受到Mtb刺激后，經(jīng)三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)MAPKKK→MAPKK→MAPK，在MAPKK處激活應(yīng)激活化的蛋白激酶（Stress－activated protein kinases，SAPK）／c－Jun氨基端激酶（C－Jun N－terminal kinases，JNK），p38MAPK和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）3 條 不 同 的MAPK支路［19］。有研究表明LAM可促進(jìn)SAPK去磷酸化及ERK酪氨酸磷酸化過(guò)程，抑制神經(jīng)酰胺（ceramide）的產(chǎn)生，有抗凋亡作用，使宿主細(xì)胞能夠在感染狀態(tài)下繼續(xù)存活，抵抗巨噬細(xì)胞的殺滅作用［18，20］。其機(jī)制可能為：（1）清除具有細(xì)胞毒性的氧自由基；（2）抑制蛋白激酶C的活性；（3）阻斷IFN－γ誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)錄；（4）誘導(dǎo)TNF－α的生成［21］。其中，TNF－α是參與炎癥誘導(dǎo)和肉芽腫形成等宿主早期免疫反應(yīng)的主要免疫因子之一，但Roach等［22］發(fā)現(xiàn)無(wú)毒株 H37Ra的LAM 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成TNF－α，而有毒株Erdman的LAM不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成TNF－α，從而認(rèn)為L(zhǎng)AM是有毒株Mtb能在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在的原因之一。

（三）ICL

ICL為Mtb乙醛酸循環(huán)途徑的關(guān)鍵酶之一，催化異檸檬酸裂解為琥鉑酸和乙醛酸。處于潛伏感染狀態(tài)下的Mtb主要通過(guò)乙醛酸循環(huán)途徑代謝脂肪酸維持生存。李俊明等［23］研究認(rèn)為異檸檬酸裂解酶通過(guò)抑制宿主細(xì)胞的凋亡可能是增強(qiáng)胞內(nèi)存活的相關(guān)重要機(jī)制之一。ICL以前被證實(shí)在Mtb的細(xì)胞內(nèi)新陳代謝中扮演著關(guān)鍵的角色，當(dāng)Mtb處于潛伏狀態(tài)或被巨噬細(xì)胞吞噬后，其ICL的表達(dá)水平顯著升高［24］。

四、Mtb休眠的基因基礎(chǔ)

有研究表明大多數(shù)活動(dòng)性結(jié)核是潛伏感染的Mtb重新被激活所致［25］。休眠狀態(tài)Mtb復(fù)蘇基因的啟動(dòng)是休眠M(jìn)tb復(fù)蘇的關(guān)鍵，阻斷復(fù)蘇基因啟動(dòng)，讓休眠M(jìn)tb永遠(yuǎn)“沉睡”是防止結(jié)核病復(fù)燃的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，與Mtb休眠相關(guān)的基因有二碳代謝基因、核糖蛋白合成下調(diào)基因及膠原基質(zhì)合成基因等［26］。也有研究表明，維生素D的代謝產(chǎn)物可活化巨噬細(xì)胞，抑制Mtb活性，且維生素D受體（VDR）基因可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和殺菌活性，影響Mtb在胞內(nèi)的存活狀態(tài)，可能會(huì)對(duì)肺結(jié)核復(fù)發(fā)有一定影響［27］。

1996年DeMaio等［28］用PCR法從 Mtb中克隆出一種Sigma因子基因（SigF），其編碼的蛋白與藍(lán)鏈絲菌和枯草桿菌的芽孢形成因子（SigF）及枯草桿菌的應(yīng)激反應(yīng)因子（SigB）相似，其mRNA在牛結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的穩(wěn)定期、氮耗竭期、冷休克時(shí)可大量表達(dá)，但在對(duì)數(shù)期不表達(dá)，在對(duì)數(shù)期后、氧化應(yīng)激時(shí)、無(wú)氧和酒精性休克時(shí)少量表達(dá)。因此有學(xué)者認(rèn)為，SigF基因的高表達(dá)在Mtb適應(yīng)休眠狀態(tài)和抵抗宿主防御反應(yīng)中有一定的作用［29］。devR基因和ATP合成下調(diào)基因也是維持Mtb休眠狀態(tài)的必需基因［30］。如果將這些休眠維持基因作為分子靶位，改變其表達(dá)方式或是結(jié)果，從而改變休眠菌的生存條件，將是防止結(jié)核病復(fù)燃的有效途徑。

休眠菌復(fù)蘇機(jī)制及相關(guān)因子

潛伏的休眠菌如何終止休眠也是目前主要的研究領(lǐng)域之一。復(fù)活促進(jìn)因子（Rpf）是休眠菌終止休眠的重要因素之一，最早在藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中發(fā)現(xiàn)，是一種抗休眠因子，可以促進(jìn)休眠期 Mtb的生長(zhǎng)［31］。Biketov等［32］研究巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb的分離培養(yǎng)時(shí)則發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb由于菌體受到損傷或處于休眠狀態(tài)，其在體外生長(zhǎng)困難，所測(cè)的單位體積內(nèi)細(xì)菌形成單位（CFU）明顯低于實(shí)際細(xì)菌濃度，當(dāng)加入Rpf后可促進(jìn)受損傷菌體或處于休眠狀態(tài)菌體的復(fù)蘇和生長(zhǎng)，生長(zhǎng)數(shù)量明顯增加，敏感度增高。

Mtb中存在5種功能部分重疊的Rpf樣蛋白，即RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和 RpfE。Kana等［33］證明在 Mtb生長(zhǎng)中5種基因都是非必需的，遺傳互補(bǔ)或加入野生型Mtb培養(yǎng)基濾液可以使休眠菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)，并且還發(fā)現(xiàn)RpfB和RpfE在功能上比RpfD更重要。Hett等［34］利用酵母雙雜交鑒定了一種能夠與RpfB結(jié)合的伴侶蛋白分子，它是一種Mtb內(nèi)肽酶，稱作Rpf相互作用蛋白A（RipA）。它們之間的相互作用是通過(guò)體內(nèi)和體外的共沉淀實(shí)驗(yàn)確定的，相互作用的結(jié)構(gòu)域在2個(gè)蛋白的C端，靠近溶菌酶結(jié)構(gòu)域。RipA是一種與細(xì)胞膜結(jié)合的分泌蛋白，也是一種肽聚糖水解酶，能夠水解細(xì)胞壁，與RpfB在同一個(gè)細(xì)胞腔隙中，熒光顯微檢測(cè)表明兩者都定位在活動(dòng)性Mtb的隔膜上。2種肽聚糖水解酶之間的相互作用，暗示它們的復(fù)合物在細(xì)胞分裂中起作用，也可能在休眠菌復(fù)活中起作用。

結(jié) 語(yǔ)

目前我國(guó)的結(jié)核病現(xiàn)狀仍不容樂(lè)觀，需對(duì)結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。而目前認(rèn)為休眠M(jìn)tb是導(dǎo)致結(jié)核菌潛伏感染的重要因素之一，休眠M(jìn)tb復(fù)蘇基因的啟動(dòng)是影響其復(fù)蘇的關(guān)鍵，這一機(jī)制的啟動(dòng)將涉及多條復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路及若干復(fù)蘇基因，若能尋求一種途徑阻止細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)或干擾復(fù)蘇基因的表達(dá)，讓休眠M(jìn)tb永遠(yuǎn)沉睡，將對(duì)降低結(jié)核病的復(fù)發(fā)率，繼而從根本上消除結(jié)核病具有重要意義。而如何阻斷其進(jìn)入休眠狀態(tài)和殺滅結(jié)核休眠菌仍需進(jìn)一步研究。

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