苯海拉明等有機胺類藥物干擾MTT還原法的應用

沈 耀，張晨輝，胡薇薇，陳 忠

(1.溫州醫(yī)學院生命科學學院，浙江溫州325035;2.浙江大學藥學院，浙江杭州310058)

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)還原法是一種簡單、靈敏、經(jīng)濟的體外檢測細胞活性和增殖的方法［1-2］。其檢測原理為:活細胞線粒體或非線粒體中的琥珀酸脫氫酶等能使外源性MTT還原為水不溶性的紫黑色結晶物——甲瓚(formazan)，并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能［3］。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可反映活細胞數(shù)量。許多文獻顯示在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比;使用MTT方法得到的實驗數(shù)據(jù)和使用其它方法所得數(shù)據(jù)一致性較高［4-5］。目前，該方法已被廣泛應用于抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選、腫瘤放射敏感性檢測、細胞毒性試驗、細胞增殖和新材料的生物兼容性以及生物活性因子的活性檢測等。

然而，MTT還原法的一些缺點致使實驗結果出現(xiàn)偏差。一些胞外物質，如抗壞血酸、維生素E和N-乙酰半胱氨酸以及一些植物提取物等，能夠在無細胞系統(tǒng)中還原MTT產(chǎn)生甲瓚［6］。此外，MTT還原法還受細胞培養(yǎng)液的pH及含糖量等的影響［7］?？梢姡贛TT還原法應用時，應排除這些潛在的干擾因素，從而得到準確的實驗結果。有機胺類藥物，如苯海拉明等在離體細胞實驗上運用的較多，而MTT還原法也經(jīng)常被用來檢測這些藥物處理后細胞的活性變化及增殖等情況。因此，本實驗將探討苯海拉明等有機胺類藥物對MTT還原法測定細胞活性準確性的影響。結果顯示，高濃度苯海拉明等有機胺類藥物可通過抑制甲瓚的外排而促進 MTT還原生成甲瓚，從而干擾實驗結果。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品和化學試劑 MTT購自生工生物工程(上海)有限公司。苯海拉明(diphenhydramine)、吡拉明(pyrilamine)、西米替丁(cimetidine)、卓蘭替丁(zolantidine)、組胺(histamine)、hoechst 33342、propidium iodide(PI)、多聚賴氨酸、阿糖胞苷購自美國Sigma公司。L-谷氨酰胺、胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 皮層星形膠質細胞培養(yǎng) 參照文獻報道［8］，在無菌條件下取出新生24 h內(nèi)的SD大鼠的全腦，小心分離左右半腦，剔除嗅球、紋狀體、海馬和基底腦組織，將皮層組織移入另一只含有冰冷解剖液的培養(yǎng)皿中，除去軟腦膜和血管。用手術刀片將皮層組織搗碎，用0.25%胰酶置于培養(yǎng)皿中，在37℃下消化15～20 min。然后加入適量培養(yǎng)液，用吸管吹打成細胞懸液，接種到經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶中。24 h后更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)10～12 d后，待培養(yǎng)瓶中細胞鋪滿瓶底時，換新鮮培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱內(nèi)2～3 h，隨后將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫搖床上，以260 r/min的速度振搖過夜，以去除混雜的神經(jīng)元細胞和小膠質細胞。次日，用PBS液洗滌細胞數(shù)次，用0.25%胰酶消化細胞成細胞懸液，按1×105cells/ml密度將細胞接種至培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或玻片，2～3 d后用于實驗。免疫細胞化學結果顯示，按此種方法獲得的膠質細胞GFAP陽性率＞95%。

1.3 藥物處理 星形膠質細胞生長至適宜密度后，加入苯海拉明、吡拉明、西米替丁，使其終濃度分別為 10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L;加入組胺、卓蘭替丁，使其終濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L，藥物分別作用 24 h，而后觀察其對星形膠質細胞MTT還原的影響。在其它實驗中采用苯海拉明(10-4mol/L)作用24 h。在各個實驗進行時都安排有平行對照組。

1.4 MTT檢測法 參照文獻報道［9］，藥物處理完畢后，96孔板細胞每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml溶于 PBS)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，棄去培養(yǎng)基，加入二甲亞砜(DMSO)，振蕩10 min左右，待結晶完全溶解后，在酶標儀測定波長490 nm處吸光值(OD490)。以正常對照組所測的MTT吸光值為基數(shù)100%，藥物處理組與正常對照組的比值百分比來計算藥物對星形膠質細胞MTT還原的影響。為了觀察MTT還原產(chǎn)生的甲瓚在星形膠質細胞內(nèi)的分布，培養(yǎng)在玻片上的細胞在藥物和MTT處理完后在光學顯微鏡(Olympus)下觀察、拍照。MTT孵育一段時間后，針狀晶體有時候出現(xiàn)在細胞的表面，它們被認為是細胞通過胞吐作用排出的甲瓚。

1.5 細胞核熒光染色 為了探索苯海拉明對星形膠質細胞增殖及活性的作用，我們采用了Hoechst 33342和 PI核熒光雙染的方法。Hoechst 33342具有高度的脂溶性，可穿透細胞膜，所以很容易進入活細胞以及凋亡的細胞。PI只能進入細胞膜有破損的細胞內(nèi)，所以只有壞死的細胞才有PI陽性反應。Hoechst 33342和PI用蒸餾水分別配成1 mg/ml的濃度加以貯存，藥物處理完后在培養(yǎng)的細胞中加入Hoechst 33342 溶液，使其終濃度為 10 μg/ml，37℃孵育10 min。然后加入PI染液，使其終濃度為 10 μg/ml，4℃，10 min。用 PBS 洗一次，4%多聚甲醛固定，熒光顯微鏡觀察(PI熒光為紅色，620 nm;Hoechst 33342熒光為藍色，480 nm)。每個玻片上隨機選取6個視野，拍照，然后細胞計數(shù)，分別計算細胞密度(反映細胞增殖情況)和細胞的凋亡及壞死率。

2 結果

2.1 苯海拉明等有機胺類藥物對星形膠質細胞MTT還原法的影響 如圖1所示，苯海拉明、吡拉明在 10-7、10-6、10-5mol/L，卓蘭替丁在 10-8、10-7、10-6mol/L 濃度時，對星形膠質細胞還原MTT為甲瓚的能力沒有影響;當苯海拉明、吡拉明濃度為10-4mol/L，卓蘭替丁濃度為10-5mol/L時，能顯著提高星形膠質細胞內(nèi)的甲瓚量;然而當苯海拉明、吡拉明濃度達到10-3mol/L，卓蘭替丁濃度達到10-4mol/L時，MTT還原為甲瓚的量顯著下降，此時光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞發(fā)生嚴重死亡。組胺(10-8～10-4mol/L)和西米替丁(10-7～10-3mol/L)對星形膠質細胞內(nèi)MTT還原為甲瓚的量沒有影響。

圖1 組胺、苯海拉明、吡拉明、卓蘭替丁、西米替丁對星形膠質細胞MTT甲瓚生成的影響Fig.1 Effects of histamine， diphenhydramine， pyrilamine， zolantidine and cimetidine on MTT formazan formation in astrocytes

2.2 苯海拉明對星形膠質細胞增殖及活性的影響 MTT還原為甲瓚的量與細胞的活性和數(shù)量密切相關，于是我們又采用了 Hoechst 33342和PI核熒光雙染的方法，來觀察苯海拉明對星形膠質細胞增值和活性的影響。苯海拉明(10-4mol/L)對星形膠質細胞的增殖沒有影響［對照組細胞密度為:(2 231±144)個/mm2;苯海拉明處理組細胞密度為:(2 145±115)個/mm2，P ＞ 0.05］，見圖2a。另一方面，從Hoechst 33342和PI染凋亡和壞死細胞的結果看，苯海拉明(10-4mol/L)孵育24 h，對星形膠質細胞的凋亡和壞死均沒有顯著影響［對照組細胞凋亡率:(3.54±0.59)%，苯海拉明處理組細胞凋亡率:(4.1±0.89)%，P＞0.05;對照組細胞壞死率:(0.16±0.14)%，苯海拉明處理組細胞壞死率:(0.18±0.15)%，P＞0.05］，見圖2b。

圖2 苯海拉明對星形膠質細胞增殖和壞死及凋亡的影響Fig.2 Effects ofdiphenhydramine on cell proliferation and necrosis and apoptosis in astrocytes

2.3 苯海拉明對MTT甲瓚的胞吐作用 MTT進入細胞后被還原為甲瓚，先以甲瓚顆粒的形式沉積在細胞內(nèi)，隨著時間的推移甲瓚顆粒逐漸變黑、增大。一段時間后甲瓚顆粒逐漸移向細胞膜，進而被排出胞外，這個過程被稱為MTT甲瓚的胞吐作用［10］。在本實驗中，MTT甲瓚的胞吐作用被高濃度苯海拉明所抑制。如圖3a所示，對照組星形膠質細胞MTT孵育2 h后，絕大多數(shù)細胞周圍均出現(xiàn)針狀甲瓚晶體(箭頭所示)。然而苯海拉明(10-4mol/L)處理24 h，顯著抑制星形膠質細胞對MTT甲瓚的胞吐作用，使甲瓚仍以顆粒狀態(tài)沉積于細胞內(nèi)(圖3b，箭頭所示)。吡拉明和卓蘭替丁均有抑制星形膠質細胞對MTT甲瓚的胞吐作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 pH對苯海拉明抑制星形膠質細胞甲瓚胞吐作用的影響 為了探索pH對苯海拉明抑制星形膠質細胞甲瓚胞吐作用的影響，在孵育苯海拉明前30 min，給細胞更換不同pH培養(yǎng)液，其它成分保持不變。實驗結果如圖4所示。正常培養(yǎng)液pH(7.2)條件下，苯海拉明抑制星形膠質細胞對MTT甲瓚的外排，如前所述。酸性pH(6.4)條件下，苯海拉明顯著抑制星形膠質細胞對MTT甲瓚的胞吐作用，致使胞內(nèi)甲瓚大量生成，生成量為對照組的136%。而偏堿性pH(8.0)條件下，苯海拉明對MTT甲瓚的胞吐作用沒有抑制作用，胞內(nèi)甲瓚的生成量為對照組的101.57%。

3 討論

細胞活性和增殖狀況的測定是評價藥物毒性，檢測各種生物活性因子的活性，構建理想的細胞模型等過程不可或缺的步驟。MTT還原法是其中最為簡單、迅速和高敏感性的檢測細胞活性與增殖的方法。然而，有些生物活性物質或藥物本身就能干擾細胞內(nèi)MTT的代謝，因此，在檢測某些化學試劑或藥物的生物毒性作用或保護性作用時就要先排除此類因素。

在本實驗中，我們采用了苯海拉明、吡拉明、西米替丁、卓蘭替丁、組胺5種有機胺類藥物。這5種胺類藥物作用于星形膠質細胞后，我們發(fā)現(xiàn)采用不同的細胞活性測定方法檢測出相互矛盾的結果。苯海拉明(10-4mol/L)、吡拉明(10-4mol/L)、卓蘭替丁(10-5mol/L)作用于星形膠質細胞24h后，采用MTT還原法測定，結果顯示OD490值顯著上升，提示這個濃度的苯海拉明、吡拉明和卓蘭替丁能夠提高星形膠質細胞的活性或者促進星形膠質細胞的增殖。而Hoechst 33342和PI核熒光雙染方法顯示，苯海拉明(10-4mol/L)作用于星形膠質細胞24 h并沒有促進細胞的增殖，同時對細胞的凋亡和壞死也沒有影響。Abe等研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣物質(β-amyloid peptide，βA)通過促進MTT甲瓚的胞吐作用來抑制MTT在細胞內(nèi)的還原［11］。因此，我們也在顯微鏡下進一步觀察苯海拉明等作用后MTT甲瓚在細胞內(nèi)的分布狀況，發(fā)現(xiàn)苯海拉明可以抑制星形膠質細胞對MTT甲瓚的胞吐作用。MTT孵育2 h后，對照組星形膠質細胞膜表面分布著大量針狀甲瓚晶體，而在苯海拉明處理組，MTT還原產(chǎn)生的甲瓚仍以顆粒狀沉積于細胞內(nèi)。MTT是一種不透膜的物質，它通過胞吞作用進入細胞［10］。當甲瓚排出細胞后以針狀晶體形式附著于細胞膜上，阻止了細胞對胞外MTT的攝取作用，從而減少胞內(nèi)MTT的濃度，進而減少甲瓚的生成。因此，我們推測苯海拉明是通過抑制甲瓚的外排來減少胞外的甲瓚晶體，使得更多的MTT通過胞吞作用進入細胞，進而產(chǎn)生更多的甲瓚。

圖3 苯海拉明抑制星形膠質細胞對MTT甲瓚的胞吐作用Fig.3 Diphenhydramine suppresses MTT formazan exocytosis in astrocytes

圖4 pH對苯海拉明抑制星形膠質細胞甲瓚胞吐作用的影響Fig.4 EffectofpH on the inhibition of formazan exocytosis induced by diphenhydramine in astrocytes

在本實驗中我們還發(fā)現(xiàn)，苯海拉明抑制甲瓚外排的作用與pH相關。當細胞培養(yǎng)液的pH小于7.2時，苯海拉明抑制甲瓚的外排作用比較明顯;而當細胞培養(yǎng)液的pH偏堿，如pH為8時，苯海拉明抑制甲瓚的外排作用消失。有文獻報道，甲瓚在細胞內(nèi)形成后主要在溶酶體內(nèi)積聚，然后被運送到細胞膜周邊經(jīng)胞吐作用而排出［10］。而Morissette等發(fā)現(xiàn)，有機胺類如普魯卡因胺、苯海拉明等在較高濃度時向溶酶體積聚而引起空泡的生成，而且這種作用與pH相關［12］。因此，我們推測偏酸性環(huán)境下更多的苯海拉明向溶酶體積聚，從而影響運載有甲瓚的溶酶體向細胞膜的移動以及胞吐過程。而在偏堿性環(huán)境下，苯海拉明向溶酶體內(nèi)積聚的作用減弱，從而使運載有甲瓚的溶酶體能夠正常向細胞膜靠近并進行胞吐。

總之，苯海拉明等一些有機胺類藥物能夠影響星形膠質細胞對MTT甲瓚的胞吐作用，從而影響MTT還原法在檢測這類藥物對星形膠質細胞活性及增殖作用的結果的準確性。因此，使用有機胺類藥物對細胞活性或增殖進行研究時，應謹慎選擇檢測方法。此外，使用MTT方法時也應謹慎檢查反應體系的各項潛在影響因素，使實驗所得數(shù)據(jù)能真實反應事實。

［1］MORGAN D M.Tetrazolium(mtt)assay for cellular viability and activity［J］.Methods Mol Biol，1998，79:179-183.

［2］MOSMANN T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays ［J］.J Immunol Methods，1983，65:55-63.

［3］AHMAD S，AHMAD A，SCHNEIDER K B，et al.Cholesterol interferes with the mtt assay in human epithelial-like(a549)and endothelial(hlmve andhcae)cells［J］.Int J Toxicol，2006，25:17-23.

［4］SMITH M D，BARBENEL J C，COURTNEY J M，et al.Novel quantitative methods for the determination of biomaterial cytotoxicity［J］.Int J Artif Organs，1992，15:191-194.

［5］LOVELAND B E，JOHNS T G，MACKAY I R，et al.Validation of the mtt dye assay for enumeration of cells in proliferative and antiproliferative assays［J］.Biochem Int，1992，27:501-510.

［6］BRUGGISSER R，VON DAENIKEN K，JUNDT G，et al.Interference of plant extracts，phytoestrogens and antioxidants with the mtt tetrazolium assay［J］.Planta Med，2002，68:445-448.

［7］VISTICA D T，SKEHAN P，SCUDIERO D，et al.Tetrazolium-based assays for cellular viability:A critical examination of selected parameters affecting formazan production ［J］.Cancer Res，1991，51:2515-2520.

［8］SHEN Y，HE P，F(xiàn)AN Y Y，et al.Carnosine protects against permanent cerebral ischemia in histidine decarboxylase knockout mice by reducing glutamate excitotoxicity ［J］.Free Radic Biol Med，2010，48:727-735.

［9］SHEN Y，HU W W，F(xiàn)AN Y Y，et al.Carnosine protects againstnmda-induced neurotoxicity in differentiated rat pc12 cells through carnosinehistidine-histamine pathway and h(1)/h(3)receptors［J］.Biochem Pharmacol，2007，73:709-717.

［10］LIU Y，PETERSON D A，KIMURA H，et al.Mechanism of cellular 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (mtt)reduction［J］.J Neurochem，1997，69:581-593.

［11］ABE K，SAITO H.Amyloid beta protein inhibits cellular mttreduction notby suppression of mitochondrialsuccinate dehydrogenase butby acceleration of mtt formazan exocytosis in cultured rat cortical astrocytes［J］.Neurosci Res，1998，31:295-305.

［12］MORISSETTE G，MOREAU E，R C G，et al.Massive cell vacuolization induced by organic amines such as procainamide［J］.J Pharmacol Exp Ther，2004，310:395-406.