高原低氧對大鼠大腦皮質(zhì)生長休止蛋白7表達(dá)的影響

李曉恒 孫朝越 胡紅梅 楊贛軍 孫 弋 彭建安 廖家萬＊

(1井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,江西343300; 2深圳市疾病預(yù)防控制中心 廣東518055)

生長休止蛋白7(Gas7)屬于生長休止基因家族的一員,是一種與細(xì)胞分化和活化相關(guān)的重要調(diào)節(jié)子[1]。研究表明 Gas7主要表達(dá)在大腦皮質(zhì)、小腦、海馬等部位[2,3],在某些條件下,它可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞[4]、PC12細(xì)胞或神經(jīng)瘤細(xì)胞向成熟和終末方向發(fā)育和分化[5,6];Gas7還具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用以抑制神經(jīng)毒素對神經(jīng)元的損傷,同時 Gas7在神經(jīng)系統(tǒng)過度表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)突起異常增生[6]。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧非常敏感,在高原低氧環(huán)境下中樞神經(jīng)系統(tǒng)會受到一定的損害,有研究表明缺氧可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死[7]。實驗運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Western-blot技術(shù)檢測 Gas7在大腦皮質(zhì)中的表達(dá)變化,進(jìn)一步探討低氧對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的影響過程中Gas7的可能作用。

材料和方法

1.實 驗動物分組和動物模型的制備

成年雄性Wistar大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)36只,體重240g左右,將動物隨機(jī)分為2組:(1)正常對照組(n=18);(2)缺氧組(n=18)。

缺氧組大鼠置于低氧箱內(nèi),調(diào)節(jié)箱內(nèi)氧濃度為8%,每天缺氧8h,持續(xù)6周。正常組除不缺氧外,其它飼養(yǎng)條件與缺氧組相同。

2.免 疫組織化學(xué)測定

2.1 標(biāo)本的制備

取實驗組和對照組大鼠各9只,經(jīng)7%水合氯醛腹腔注射麻醉后,行開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管,先用37℃生理鹽水100ml快速灌流沖洗血液,再用預(yù)冷的含4%多聚甲醛的0.1mol/LPB(p H7.4)300ml作灌流固定。取腦并修取大腦頂端在上述固定液中后固定約 6-8 h(4℃),再用0.1mol/L PB(p H7.4)浸洗兩次后,常規(guī)上行酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。然后用石蠟切片機(jī)行連續(xù)冠狀切片,片厚5μm,貼于硌礬-明膠載片,烤干備用

2.2 免疫組織化學(xué)反應(yīng)

Gas7免疫組織化學(xué)染色:切片常規(guī)脫蠟入水,0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,3%牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性反應(yīng),羊抗Gas7多克隆抗體(1:100,Santa Cruz)室溫下孵育切片過夜;生物素化兔抗羊Ig G(1:200,北京中山)室溫下孵育1 h;SP(1:200,北京中山)室溫下孵育1h。用抗體稀釋液替代羊抗Gas7多克隆抗體進(jìn)行陰性對照。

運(yùn)用Image-Pro Plus Version 5.0彩色圖像分析系統(tǒng),以切片背景作背底校正,對每張切片 Gas7免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行光密度測定,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

3.W estern blot測定

2組大鼠中各取9只快速斷頭取大腦皮質(zhì),加入細(xì)胞裂解液(0.05mol/L Tris-HCl pH 7.4,0.05mol/L NaCl,1%Triton×-100,0.001mol/L EDTA pH8.0,0.01 mol/L PMSF,胃酶抑制劑 8μl,胰酶抑制劑200μl)勻漿,轉(zhuǎn)移至離心管中,超聲破碎;12000r/min 4℃離心20min,取上清;加上樣緩沖液(2mol/L Tris-HCl p H6.8,20%SDS,0.25%甘油 ,10%β-巰基乙醇,0.5%溴酚藍(lán));取樣品加到各個泳道,恒壓(110v)電泳,12%SDS-PAGE分離蛋白樣品,;將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上,275mA恒流轉(zhuǎn)膜,2h,室溫下將NC膜用5%脫脂牛奶/0.01PBS封閉1h;用羊抗Gas7多克隆抗體(1:600)4℃過夜;5%脫脂牛奶/0.01mol/L PBS漂洗3次,每次10min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊Ig G(1:200)室溫孵育2h;漂洗膜,用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL plus Western Blitting Detection System,Amersham)在 X線膠片曝光后進(jìn)行觀察。將X光膠片置于疑膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)測定目標(biāo)帶光密度,與內(nèi)參照光密度值相比后再行統(tǒng)計分析。

4.統(tǒng) 計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS-11.5進(jìn)行 t檢驗,P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.G as7免疫組織化學(xué)結(jié)果

Gas7免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色細(xì)小顆粒,主要表達(dá)在大鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元胞質(zhì)和突起內(nèi),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)無陽性表達(dá)。與對照組相比,低氧組陽性染色加深,圖像分析結(jié)果顯示:與正常對照組比較,低氧組平均光密度明顯上升(P<0.05)(圖1,表1)

圖1 大鼠大腦皮質(zhì)Gas7免疫反應(yīng)性的分布。A:低氧組;B:正常對照組;SABC法×200Fig.1 Distribution of the Gas7 immunoreactivities in the cerebr al cortex.A:hypoxia group;B:rats in control group;SABC immunohistochemical staining,×200

表1 二組大鼠大腦皮質(zhì) Gas7表達(dá)水平的比較(ˉx±S,n=9,OD 值)Table 1 Gas7 expression levels in the cerebral cortex of rats(ˉx ±S,n=9,OD ratio)

2.W estern blot分析結(jié)果

Western blot檢測表明,低氧組大鼠大腦皮質(zhì)Gas7表達(dá)明顯增強(qiáng),與正常對照組相比,差異具有顯著性(P<0.05)(圖2,表2)。

圖2 大鼠大腦皮質(zhì) Gas7蛋白水平 A:低氧組;B:對照組 ;(Gas7 38kDa;β-actin,42kDa)Fig.2 The levels of Gas7 protein in the cerebral cortex by Western blot..A:hypoxia group;B:the control group;(Gas7 38kDa andβ-actin 42kDa)

表2 二組大鼠皮質(zhì) Gas7的Western blot定量分析結(jié)果(ˉx ±S)Table 2 Western blot analyses of Gas7 level in the cerebral cortex of rats(ˉx ±S)

討 論

生長休止基因家族是一種與細(xì)胞分化和活化相關(guān)的重要調(diào)節(jié)子[1],他們能夠編碼一些蛋白,其中生長休止特定蛋白7(Gas7)就是其中的一種,它最先是在1998年由臺灣學(xué)者林淑端等[8]在去血清的NIH3T3細(xì)胞和 PC12中分離出來的,后來發(fā)現(xiàn)它廣泛地分布于大腦皮質(zhì)、海馬、小腦,其它一些器官也有表達(dá)[9],目前的研究表明,在神經(jīng)系統(tǒng)中,Gas7主要表達(dá)在神經(jīng)元的核周質(zhì)中,在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少[4]。在人類成神經(jīng)元瘤檢測中發(fā)現(xiàn) Gas7位于染色體17p11.3,或在等臂染色體17q的假定斷裂點內(nèi)[10]。Gas7在神經(jīng)系統(tǒng)過度表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)突起異常增生[6],最近的研究認(rèn)為,在某些條件下,Gas7可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞[4]、PC12細(xì)胞或神經(jīng)瘤細(xì)胞向成熟和終末方向發(fā)育和分化[5,6]。

研究模擬低氧環(huán)境對大鼠進(jìn)行長達(dá)6周的飼養(yǎng),觀察低氧環(huán)境中大鼠大腦皮質(zhì) Gas7的表達(dá)變化,探討Gas7的功能以及低氧環(huán)境對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的影響。我們的研究觀察到,Gas7免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色細(xì)小顆粒,表達(dá)在大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的胞漿和突起內(nèi),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)無陽性表達(dá)。與對照組相比,低氧組免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng);Western blot結(jié)果顯示,低氧組大鼠海馬Gas7免疫反應(yīng)陽性表達(dá)增強(qiáng),提示 Gas7蛋白含量增多。

在高原低氧組大鼠大腦皮質(zhì)中的 Gas7表達(dá)明顯增強(qiáng),說明 Gas7參與了低氧對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的影響;同時,早期的研究表明低氧可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死,提示:在低氧狀態(tài)下,Gas7可能與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的存活有關(guān),參與了高原低氧對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的影響。

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