鈣離子和氯化鈷促進(jìn)成纖維細(xì)胞色素上皮衍生因子的表達(dá)

楊明峰 程厚文 孫保亮,2 袁 慧,2 謝方民,2 張顏波,2

(1泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院; 2山東省高校腦微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 泰安 271000)

血管新生的調(diào)節(jié)影響一系列的生理和病理過程,其中最重要的、也是效力最強(qiáng)的血管新生抑制劑是色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)[1]。截至目前,多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)PEDF廣泛表達(dá)于人體多種組織中,而且發(fā)揮多種不同的生物學(xué)功能[2]。已有研究發(fā)現(xiàn),皮膚中PEDF主要表達(dá)于真皮層[3]。為了進(jìn)一步證實(shí)PEDF在真皮成纖維細(xì)胞的表達(dá),以及鈣離子和氯化鈷對(duì)其表達(dá)的影響,我們進(jìn)行了初步的研究。

材料和方法

1.標(biāo) 本來源

19例包皮標(biāo)本均來自男性包皮環(huán)切術(shù)者,此前三個(gè)月內(nèi)未接受過其它任何治療。年齡11-59歲,平均年齡31.36±13.19。以40歲為界,將標(biāo)本分為組 I(40歲以下,13例,平均年齡23.76±6.60)和組 II(40歲以上,6例,平均年齡47.83±6.41)。標(biāo)本切除后,立即在無菌通風(fēng)櫥中剪取小塊真皮組織,置于0.1%I型膠原酶(Gibco,Invitrogen,美國)中4oC過夜。

2.成 纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

在過夜后的I型膠原酶中加入胎牛血清中止反應(yīng),輕輕吹打組織,離心后獲得成纖維細(xì)胞,使用高糖DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)種植于 50ml培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)條件為5%CO2、恒溫37°C培養(yǎng)箱。

3.免 疫熒光檢查

成纖維細(xì)胞用0.25%胰酶/EDTA消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞后,以4×105密度接種于預(yù)先放置有無菌蓋玻片的六孔板中。待細(xì)胞爬片至約60-70%后取出蓋玻片,4%多聚甲醛室溫固定20min,PBS沖洗。置入預(yù)熱的10m mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(p H 7.5)95°C加熱20min進(jìn)行抗原釋放,然后以10%山羊血清室溫封閉1h,抗PEDF抗體(Sant-Cruz,美國)4°C孵育過夜。PBS洗后,FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:50,Jackson,美國)避光條件下室溫孵育2h,然后用碘化丙啶復(fù)染20min,最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。以正常小鼠血清IgG1取代一抗作陰性對(duì)照。

4.鈣 離子和氯化鈷對(duì)PEDF的作用

取生長于50ml培養(yǎng)瓶中融合度約90%的成纖維細(xì)胞,用無血清MEM/0.5%BSA饑餓24h后,1.0mM氯化鈣或100u mol/L氯化鈷孵育24h后中止反應(yīng),同時(shí)以PBS作為對(duì)照。

5.逆 轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

細(xì)胞總 RNA的提取按照說明書進(jìn)行操作。20μl逆轉(zhuǎn)錄體系包括 4μl 5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、50mmol/L dNTP 混合液、0.5μg Oligo(dT)18、2μg總 RNA、20U RNA酶抑制劑 (Promega)、200U MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)、DEPC水補(bǔ)足 20μl。42°C 60min 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,95°C 10min 熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后,-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

引物參照已發(fā)表文獻(xiàn)[4],由上海生工公司合成。PEDF 引 物 (5’-GTCTTTGA GAAGAAGCTGCGC-3’/5’-TCCACCTTGAGTCAGCTTGAT-3’)擴(kuò)增片斷長645 bp。PCR反應(yīng)采用 25μl體系 (10 pmol各對(duì)上下游引物、200mmol/L dNTP混合液、2mmol/L MgCl2、p H 8.3 10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl、2U Taq 酶、1μl cDNA)。反應(yīng)程序?yàn)?95 °C 5min,1 循環(huán);95°C 1min,59°C 1min,72 °C 1min,35循環(huán);72°C 10min。反應(yīng)產(chǎn)物在含有適量溴化乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳,在凝膠成像儀觀察并拍照,產(chǎn)物測序由上海生工公司完成。以未加逆轉(zhuǎn)錄酶的總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物代替cDNA模板作為陰性對(duì)照 ,排除DNA污染。GAPDH(5 ’-ATGCCGCTATCGAAAATGTCTT-3 ’/5 ’-AA TCACTTGCCGCCC TCCTA-3’)作為內(nèi)對(duì)照。

6.統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析

將RT-PCR擴(kuò)增條帶和 Western blot條帶密度分別與相對(duì)應(yīng)的 GAPDH條帶密度進(jìn)行比較。計(jì)量資料利用SPSS 13.0軟件包中ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié) 果

1.免 疫熒光結(jié)果

免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)PEDF大量表達(dá)于培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞胞漿中(圖1A),而陰性對(duì)照未見表達(dá)(圖 1B)。

圖1 PEDF在成纖維細(xì)胞中的免疫熒光定位。A,PEDF抗體孵育,綠色熒光信號(hào)為PEDF,紅色熒光信號(hào)為碘化丙啶負(fù)染細(xì)胞核。B,陰性對(duì)照。(×200)Fig.1 Immunolocalization of PEDF in fibroblasts.A.Fibroblasts incubated with anti-PEDF antibody. Green signal is PEDF,red signal is PI.B.Negative control.(×200)

2.正 常成纖維細(xì)胞表達(dá) PEDF mRNA,但在不同年齡段之間差異無顯著性

RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞表達(dá)PEDF mRNA(圖2),PCR產(chǎn)物位于645bp。組 I表達(dá)條帶相對(duì)密度值為1.192±0.115,組II條帶相對(duì)密度值為1.181±0.075,二者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖 2)。

圖2 正常成纖維細(xì)胞表達(dá) PEDF的 RT-PCR結(jié)果。PEDF擴(kuò)增片斷長度為645bp。GAPDH擴(kuò)增301bp片段作為內(nèi)參照。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),Lane 6為陰性對(duì)照。Fig.2 Expression of PEDF at mRNA level determined by RT-PCR.PCR product of PEDF is at 645bp.GAPDH served as an internal control.M,DNA molecular weight;Lane 6,negative control.

3.鈣 離子和氯化鈷促進(jìn)成纖維細(xì)胞PEDF mRNA的表達(dá)

1.0 mmol/L氯化鈣孵育24h后,PEDF mRNA條帶相對(duì)密度值為 2.592±0.315,是未孵育前(1.122 ±0.091)的 2.3 倍(P<0.01)(圖 3);100μ mol/L氯化鈷孵育24h后,PEDF mRNA條帶相對(duì)密度值為1.611±0.155,是未孵育前的1.4倍(P<0.05)(圖 3)。

圖3 鈣離子和氯化鈷作用后 PEDF mRNA的表達(dá)。M,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);Lane 1,無鈣離子或氯化鈷作用的成纖維細(xì)胞;Lane 2-4,鈣離子孵育的成纖維細(xì)胞;Lane 5-7,氯化鈷作用的成纖維細(xì)胞;Lane 8,PBS對(duì)照;Lane 9,陰性對(duì)照。Fig.3 Expression of PEDF mRNA after incubated with calcium and CoCl2.Lane 1,fibroblasts without calcium or CoCl2;Lane 2-4,fibroblasts incubated with calcium;Lane 5-7,fibroblasts incubated with CoCl2.Lane 8,a PBS control;Lane 9,negative control.

討 論

PEDF是一分泌糖蛋白,最初發(fā)現(xiàn)于胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,能夠誘導(dǎo)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[5]。后來的研究發(fā)現(xiàn)PEDF表達(dá)于多種組織和細(xì)胞,包括角膜、肺、腎臟、胰腺、前列腺、骨、睪丸以及軟骨基質(zhì)等[6,7]。而且,PEDF具有很強(qiáng)的血管生成抑制作用[1,8],具有多種生物學(xué)功能[2]。最近的一些研究發(fā)現(xiàn),PEDF與多種病理狀態(tài)如慢性炎癥性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥以及腫瘤等具有相關(guān)性[9,10]。PEDF不僅具有抗血管新生作用,而且是一重要的內(nèi)源性抗炎癥因子[11],PEDF可能通過減少 TNF和 IL-18發(fā)揮抗炎癥作用[12]。PEDF也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的分化[13]。正是基于對(duì) PEDF多種作用的認(rèn)識(shí),我們研究了PEDF在皮膚真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。

1999年,Tresini等發(fā)現(xiàn)人真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)PEDF[14],后來又有研究進(jìn)一步驗(yàn)證了 PEDF在真皮成纖維細(xì)胞的表達(dá)[3]。我們的研究亦表明,成纖維細(xì)胞表達(dá)PEDF mRNA及其蛋白質(zhì),且免疫熒光結(jié)果顯示PEDF主要分布在成纖維細(xì)胞胞漿中。但是,我們的研究沒有發(fā)現(xiàn) PEDF在不同年齡段人群之間的差異,這與 Francis等[3]的研究結(jié)果相反,他們發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加,PEDF表達(dá)有降低的趨勢。這一結(jié)果的差異可能由于我們所研究的高年齡段人群相對(duì)較少的緣故。

由于考慮到鈣離子在細(xì)胞的增殖和分化中的重要作用,以及氯化鈷對(duì)缺氧的誘導(dǎo)作用,我們又進(jìn)一步研究了鈣離子和氯化鈷對(duì) PEDF的調(diào)解作用。從我們的研究結(jié)果看,鈣離子和氯化鈷均能促進(jìn)成纖維細(xì)胞PEDF mRNA的表達(dá),而且鈣離子的作用似乎更強(qiáng)一些。其中的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。結(jié)合近來有關(guān) PEDF的表達(dá)能夠被10%FBS促進(jìn)[15],這些結(jié)果說明,PEDF在皮膚中的表達(dá)可能受到血清中多種因素的調(diào)節(jié),包括血清中的鈣離子和由于缺氧導(dǎo)致的血清中某些細(xì)胞因子的改變等。

總之,我們的研究發(fā)現(xiàn),PEDF表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞,而且其表達(dá)受鈣離子和氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧的調(diào)解。這一結(jié)果說明,我們可以通過調(diào)節(jié)鈣離子或缺氧,來調(diào)節(jié) PEDF的表達(dá),從而達(dá)到調(diào)節(jié)真皮血管新生的作用。

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