頭孢哌酮鈉和卡那霉素在豚鼠化膿性中耳炎中的作用及耳毒性機(jī)制研究

簡 雷 蔡昌學(xué)

(1武漢商業(yè)職工醫(yī)院耳鼻喉科,武漢430021;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,武漢430030)

化膿性中耳炎是中耳粘膜、骨膜或深達(dá)骨質(zhì)的化膿性炎癥,常與乳突炎合并存在[1]。本病是耳鼻咽喉科常見疾病之一。臨床上以耳內(nèi)反復(fù)流膿、鼓膜穿孔及聽力減退為特點(diǎn)。嚴(yán)重者可使中耳傳音結(jié)構(gòu)受到破壞,引起嚴(yán)重的顱內(nèi)、外并發(fā)癥而危及生命。近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用,耐藥菌株不斷產(chǎn)生和增加,給化膿性中耳炎的治療帶來了困難[2]。

中耳炎的主要致病菌是金黃色葡萄球菌,因此利用金黃色葡萄球菌中耳炎的動(dòng)物模型可以更好的了解和防治該疾病?？敲顾厥且环N氨基糖苷類廣譜抗生素,主要對(duì)革蘭陰性菌如克雷伯菌屬、變形桿菌屬、肺炎桿菌等具有良好抗菌作用。卡那霉素對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌也有良好的抗菌作用?？敲顾刂饕c細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合,抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。頭孢哌酮鈉是第三代廣譜半合成頭孢菌素,能對(duì)抗多種β-內(nèi)酰胺酶的降解作用,抗菌譜廣,對(duì)革蘭陽性菌及陰性菌都有作用。臨床上主要用于敏感菌引起的各種感染[3]。為了解金黃色葡萄球菌中耳炎的耐藥特點(diǎn),本課題將在化膿性中耳炎的豚鼠模型上使用卡那霉素和頭孢哌酮鈉,以探討不同類型抗生素在豚鼠化膿性中耳炎中的抗炎作用和耐藥性,做到合理使用抗生素。

材料和方法

1.動(dòng) 物分組及處理

45只健康白色赤目純種雄性豚鼠,耳廓反射靈敏,體重350g-400g,鼓膜完整,結(jié)構(gòu)標(biāo)志清楚,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。豚鼠在顯微鏡下右側(cè)鼓膜前下方穿刺,向鼓室內(nèi)注射制備的濃度為108CFU/L金黃色葡萄球菌懸液0.2 ml,左耳注入0.2 ml無菌生理鹽水作為對(duì)照。隔2天顯微鏡下右側(cè)鼓膜無菌條件下沿前次注射針孔再次向鼓室內(nèi)注射制備的濃度為108CFU/L金黃色葡萄球菌懸液0.2 ml,左耳同法注射0.2 ml無菌生理鹽水。再隔2天重復(fù)一次,共注射3次。最后1次注射完成24h后,顯微鏡下觀察:豚鼠右耳鼓室內(nèi)有膿液,鼓膜顯著充血、紅腫,細(xì)菌培養(yǎng)為接種的金黃色葡萄球菌者作為化膿性中耳炎模型。按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃,三組豚鼠右耳分別給予卡那霉素滴耳劑、頭孢哌酮鈉滴耳劑和生理鹽水。每只右耳滴藥0.2 ml,使藥液充滿外耳道,維持10min后清理干凈,每天2次,連續(xù)給藥7天。

2.聽 性腦干反應(yīng)

將豚鼠用10%水合氯醛按0.25 mg/Kg體重麻醉,刺激聲為短音,重復(fù)率為20次/秒,平均疊加次數(shù)為1024KHz,掃描時(shí)間為10ms。記錄電極位于豚鼠顱頂,給聲耳及對(duì)側(cè)耳后皮下分別刺入?yún)⒖茧姌O和接地電極。ABR的閾值按豚鼠的Ⅲ波作為標(biāo)準(zhǔn)。金黃色葡萄球菌菌苗中耳腔注射前檢測一次,排除聽力異常的豚鼠,選取正常者為研究對(duì)象;造模成功后和抗生素滴耳后分別檢測1次,得到其閾值。

3.細(xì) 菌培養(yǎng)

給藥結(jié)束后,將豚鼠麻醉并斷頭處死,取出右耳聽泡,在耳蝸頂打開一個(gè)小孔,在顯微鏡下觀察中耳腔內(nèi)炎癥情況。根據(jù)膿性分泌物多少進(jìn)行評(píng)分:0分表示無膿性分泌物,1分表示膿性分泌物占中耳腔容積的1/3,2分表示膿性分泌物占中耳腔容積的2/3,3分表示膿性分泌物充滿整個(gè)中耳腔。然后取中耳腔分泌物接種于瓊脂培養(yǎng)基平板上,37℃培養(yǎng)18小時(shí),再進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

4.耳 蝸基底膜鋪片和形態(tài)學(xué)觀察

將取出的右耳聽泡打開圓窗和前庭窗,在耳蝸蝸尖打開一個(gè)小孔,用4%多聚甲醛室溫固定1小時(shí)后,在PBS中分離耳蝸基底膜。將基底膜置于玻片上,用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色液(PBS稀釋倍數(shù)為1:250)滴在基底膜上,室溫避光保存30分鐘。然后將染色標(biāo)本用 PBS清洗5次后,將碘化丙錠染色液(5 ug/ml)滴在基底膜上,室溫避光保存10分鐘。然后用 PBS清洗標(biāo)本,最后滴上抗熒光退變劑封片。熒光顯微鏡下觀察損傷毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,共聚焦顯微鏡下拍照。

5.統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。各組間差異采用方差分析,P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P<0.05有顯著差異,采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較。

結(jié) 果

1.各 組ABR閾值

如表1所示,同一組內(nèi)造模前和造模后ABR閾值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明化膿性中耳炎豚鼠模型造模成功。造模前和造模后各組間ABR閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后各組ABR閾值,頭孢哌酮鈉組和卡那霉素組均低于生理鹽水組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。頭孢哌酮鈉組ABR閾值低于卡那霉素組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組ABR閾值(n=15,ˉx±s,dB peSPL)T able 1 ABR threshold before and after the modeling as well as during the whole period of experiment(n=15,ˉx ±s,dB peSPL)

2.膿 性分泌物評(píng)分和菌落計(jì)數(shù)

給藥結(jié)束后,將豚鼠麻醉并斷頭處死,取出右耳聽泡,觀察中耳炎癥情況:如表2所示,頭孢哌酮鈉組和卡那霉素組膿性分泌物比生理鹽水組少,其結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。頭孢哌酮鈉組與卡那霉素組之間膿性分泌物結(jié)果相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？敲顾亟M細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)較少,頭孢哌酮鈉組較多,生理鹽水組最多。頭孢哌酮鈉組和卡那霉素組均低于生理鹽水組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。頭孢哌酮鈉組高于卡那霉素組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)后各組中耳炎膿性分泌物評(píng)分和菌落計(jì)數(shù)(ˉx±s)T able 2 The infiltrating status of inflammatory cells in middle ear mucosa and the number of bacterial flora(ˉx ±s)

3.耳 蝸基底膜形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示,生理鹽水組(A組)三排外毛細(xì)胞排列整齊,紅色 PI染色的毛細(xì)胞核大小一致,染色均勻,外形規(guī)則,排列有序,無明顯細(xì)胞核缺失,綠色FITC染色纖毛呈V型排列,表皮板完好,結(jié)構(gòu)正常;頭孢哌酮鈉組(B組)可見三排外毛細(xì)胞排列整齊,紅色毛細(xì)胞核大小一致,染色均勻,外形規(guī)則,排列有序,綠色纖毛呈V型排列,表皮板完好,結(jié)構(gòu)正常;卡那霉素組(C組)可見三排外毛細(xì)胞核均有不同程度的缺失,第一排損傷最嚴(yán)重,呈現(xiàn)大片缺失,相同部位的纖毛和表皮板也可見缺失。

圖1 基底膜形態(tài)學(xué)觀察(n=6)A、B、C分別是生理鹽水組(A組)、頭孢哌酮鈉組(B組)和卡那霉素組(C組)基底膜鋪片的典型形態(tài)圖。白色箭頭示損傷的外毛細(xì)胞,黃色箭頭示缺失的纖毛和表皮板。Fig.1 Surface preparation technique of the basilar membrane(n=6)A,B,C representsurface preparation morphological changes of the basilar membrane in saline group,cefoperazone sodium group and kanamycin group,respectively.

討 論

中耳炎的主要致病菌是金黃色葡萄球菌[4-6],因此利用金黃色葡萄球菌中耳炎的動(dòng)物模型可以更好的了解和防治該疾病?？敲顾厥且环N氨基糖苷類廣譜抗生素,主要對(duì)革蘭陰性菌如克雷伯菌屬、變形桿菌屬、肺炎桿菌等具有良好抗菌作用?？敲顾貙?duì)耐藥性金黃色葡萄球菌也有良好的抗菌作用?？敲顾刂饕c細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合,抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成[7]。但是,氨基糖苷類抗生素具有耳毒性,約5%的病人會(huì)導(dǎo)致明顯聽力下降。頭孢哌酮鈉是第三代廣譜半合成頭孢菌素,能對(duì)抗多種β-內(nèi)酰胺酶的降解作用,抗菌譜廣,對(duì)革蘭陽性菌及陰性菌都有作用。臨床上主要用于敏感菌引起的各種感染[8]。

在本研究中,ABR的結(jié)果顯示生理鹽水組聽力損失最嚴(yán)重,卡那霉素組其次,而頭孢哌酮鈉組最輕。膿性分泌物評(píng)分和菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示,卡那霉素組膿性分泌物和菌落數(shù)最少,頭孢哌酮鈉組其次,而生理鹽水組膿性分泌物和菌落數(shù)最多。根據(jù)膿性分泌物評(píng)分和菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果,我們推測,卡那霉素和頭孢哌酮鈉均有顯著的抗金黃色葡萄球菌的作用,而且卡那霉素的抗菌作用強(qiáng)于頭孢哌酮鈉。但是ABR的結(jié)果顯示,卡那霉素組的聽力比頭孢哌酮鈉組聽力差。因此,我們推測卡那霉素具有某些耳毒性的因素,影響了卡那霉素對(duì)聽力的改善作用?？敲顾囟拘园▽?duì)前庭和耳蝸兩部分作用,其中對(duì)耳蝸的損害最嚴(yán)重[8]。有研究認(rèn)為,高濃度的卡那霉素,不論是全身或局部用藥,藥物均可達(dá)到內(nèi)耳淋巴液,使內(nèi)耳毛細(xì)胞受損[9]。Sha SH等發(fā)現(xiàn),卡那霉素首先損傷Corti氏器的外毛細(xì)胞,從耳蝸的底回開始,逐漸向耳蝸頂回發(fā)展,隨后累及內(nèi)毛細(xì)胞、耳蝸血管紋細(xì)胞、支持細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[10]。本研究的耳蝸基底膜形態(tài)學(xué)結(jié)果表明,卡那霉素對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重,尤其是第一排外毛細(xì)胞,呈現(xiàn)大片缺失,相同部位的纖毛和表皮板也可見缺失,而內(nèi)毛細(xì)胞基本完整,損傷不明顯。同時(shí),頭孢哌酮鈉組內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞均無損傷,表明頭孢哌酮鈉無內(nèi)耳毒性。因此我們推測,由于卡那霉素具有的損傷內(nèi)耳毛細(xì)胞的耳毒性,導(dǎo)致針對(duì)化膿性中耳炎治療時(shí)效果不佳。雖然生理鹽水組內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞均無損傷,但生理鹽水組聽力損失最嚴(yán)重,表明此模型豚鼠的中耳傳音結(jié)構(gòu)受到破壞,但沒有影響到內(nèi)耳結(jié)構(gòu)。

本課題在化膿性中耳炎的豚鼠模型上使用卡那霉素和頭孢哌酮鈉,探討了不同類型抗生素在豚鼠化膿性中耳炎中的抗炎作用,做到合理使用抗生素。本研究發(fā)現(xiàn),雖然卡那霉素和頭孢哌酮鈉均有顯著的抗金黃色葡萄球菌的作用,但是卡那霉素具有明顯的耳毒性,因此在治療金黃色葡萄球菌引起的化膿性中耳炎時(shí),推薦使用頭孢哌酮鈉。

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