鼻咽癌CT表現(xiàn)與Annexin A7蛋白表達關(guān)系的研究

楊民正，梁慶模

（1.永州市人民醫(yī)院，湖南 永州 425006；2.南華大學附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是臨床常見的十大惡性腫瘤之一，約占頭頸部惡性腫瘤的50%以上[1]。NPC的CT掃描是判定鼻咽癌淺層受累、深部蔓延、顱底骨質(zhì)破壞及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效手段[2]。這些CT征象是由腫瘤的組織病理學特性及生物學行為所決定的。Annexin A7的表達水平和空間分布的變化與多種類型腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移進程密切相關(guān)，從而影響惡性腫瘤的組織病理學特性。分析NPC的CT表現(xiàn)與Annexin A7蛋白異常表達的關(guān)系，研究影像學表現(xiàn)的分子病理學基礎，將會提高對NPC CT表現(xiàn)的認識水平。

本研究通過研究Annexin A7表達與NPC分化、轉(zhuǎn)移及CT征象的關(guān)系，分析其與NPC臨床預后的相關(guān)性，對NPC的惡性度及預后進行評估，從而為臨床診治提供更有價值的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

湖南省永州市人民醫(yī)院2008年1月～2010年1月手術(shù)標本，58例NPC患者、20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌（LMNPC）和24例慢性鼻咽炎患者的石蠟標本。CT檢查后均經(jīng)病理活檢證實。全部標本均用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。5μm連續(xù)切片。

1.2 試劑

Annexin A7兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司、SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 CT掃描方法

CT掃描設備為Siemens Sensation 16層螺旋CT掃描機。病人取常規(guī)仰臥位，平靜呼吸，顱底掃描平面與OM線平行，掃3～4層，層厚、層距5mm，鼻咽區(qū)CT常規(guī)軸位平掃，層厚、層距5mm，從鼻咽頂壁掃至口咽，口咽以下，加3～4層，層厚、層距10mm，部分病例同時做冠狀位掃描和增強掃描。增強掃描的方法及范圍與軸位平掃一致，所使用的碘對比劑為江蘇揚子江藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)的非離子型碘對比劑30%碘海醇注射液，劑量為60～100ml，注射方法采用靜脈團注法，注射速率為2～3ml/s。

1.4 免疫組織化學方法

免疫組織化學染色采用S-P法進行。主要步驟:①石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3次，每次3min；②抗原修復：將處理好的切片置于枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯中，加熱至沸騰5min，自然冷卻至室溫，PBS液沖洗兩次；③每張切片加一滴過氧化物酶阻斷溶液（試劑A），室溫下孵育10min。PBS沖洗3次，每次3min；④除去PBS液，加一滴正常非免疫動物血清（試劑B），室溫下孵育10min；⑤除去血清，分別加入兔抗人Annexin A7抗體（1∶150稀釋），4℃過夜。用PBS代替一抗為陰性對照，PBS沖洗3次，每次3min；⑥每張切片加一滴生物標記的二抗（試劑C），室溫下孵育 10min。PBS 沖洗 3 次，每次 3min；⑦每張切片加一滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10min。PBS沖洗3次，每次3min；⑧每張切片加二滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min；⑨自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍；⑩梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5 結(jié)果判斷

Annexin A7免疫反應陽性物質(zhì)定位于胞漿和胞膜，隨機選取至少10個高倍鏡視野（×200），至少計數(shù)1000個細胞，以積分法計算結(jié)果。即根據(jù)每張切片的染色強度和陽性細胞比例計分。著色強度：無色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。著色細胞比例：無著色0分；＜30%為1分；30%～60%為2分；≥60%為3分。兩者相加0～2分為弱陽性或陰性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。陽性率＝（陽性數(shù)+強陽性數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學分析

通過SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Annexin A7蛋白在NPC、LMNPC和慢性鼻咽炎鼻咽上皮中的表達

NPC患者中Annexin A7陽性率為87.9%（51/58），LMNPC 中陽性率為 95.0%（19/20），對照組慢性鼻咽炎鼻咽上皮中陽性率為41.7%（10/24），Annexin A7表達在LMNPC中高于NPC，NPC中高于對照組，差異有顯著性意義（表 1，圖 1，P＜0.05）。

2.2 Annexin A7蛋白表達與NPC臨床病理特征的關(guān)系

圖1 NPC、LMNPC和慢性鼻咽炎鼻咽上皮中Annexin A7表達情況。圖1a：慢性鼻咽炎鼻咽上皮；圖1b：中分化 NPC；圖 1c：低分化 NPC；圖 1d：LMNPC。Figure 1.The expression of Annexin A7 in NPC,LMNPC and chronic rhinitis(CR).Figure 1a:CR;Figure 1b:Moderate-differentiated NPC;Figure 1c:Low-differentiated NPC;Figure 1d:LMNPC.

表1 鼻咽癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鼻咽癌和慢性鼻咽炎鼻咽上皮中Annexin A7的表達情況

表2 Annexin A7表達與NPC臨床病理特征關(guān)系

Annexin A7表達與組織分化程度、局部轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（表2，P＜0.05），而與年齡、性別無關(guān)。Annexin A7表達越高，傾向于分化越差、更容易發(fā)生局部和遠處轉(zhuǎn)移、容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后較差。

2.3 鼻咽癌CT表現(xiàn)與Annexin A7表達的關(guān)系

Annexin A7表達與CT征象中的侵及后鼻孔、侵及口咽部、顱底骨質(zhì)破壞及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（圖 2，表 3，P＜0.05），與腫塊單側(cè)或多側(cè)、是否有莖突旁軟組織腫塊無關(guān)，說明Annexin A7蛋白表達與腫瘤的浸潤性生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表3 鼻咽癌CT征象與Annexin A7表達關(guān)系

3 討論

CT征象是由腫瘤的組織病理學特性及生物學行為所決定的。而現(xiàn)代分子生物學的研究使在蛋白質(zhì)水平和基因水平解釋腫瘤的組織病理學特征成為可能，從而有助于解釋腫瘤影像表現(xiàn)的多樣性和復雜性。因此，將影像醫(yī)學與分子生物學和分子病理學結(jié)合，研究腫瘤影像學表現(xiàn)的分子病理學基礎，將會提高對腫瘤影像學表現(xiàn)的認識水平，從而為臨床診斷、選擇治療方案、判斷療效和評估預后等，提供更多、更有價值的信息[3-4]。目前，CT掃描是臨床上診斷NPC的主要手段，它不但能良好顯示鼻咽腔的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，還能顯示病變向鄰近組織結(jié)構(gòu)深入蔓延的范圍，以及顱底骨質(zhì)受侵和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況[5]。

圖2 鼻咽癌CT表現(xiàn)。圖2a：侵及后鼻孔；圖2b：侵及右側(cè)口咽部；圖2c：左側(cè)顱底骨質(zhì)破壞；圖2d：右側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Figure 2.CT of nasopharyngeal carcinoma.Figure 2a:invading posterior nares;Figure 2b:invading right pharynx oralis;Figure 2c:destruction of left basion;Figure 2d:right cervical lymph node metastasis.

膜聯(lián)蛋白（Annexins）是一種高度保守、廣泛表達、具有多種重要功能、分子量為28～33kD的鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白超家族，與腫瘤細胞的增殖與分化、細胞骨架蛋白間的相互作用和維持細胞外基質(zhì)的完整性等方面有關(guān)[6-7]。Annexin A7是從牛腎上腺髓質(zhì)分離純化出的一種蛋白質(zhì)，由于它能使嗜鉻細胞顆粒聚集，故稱為會聯(lián)蛋白（synexin），與膜運輸、信號轉(zhuǎn)導、細胞分化和增殖有關(guān)[8-9]。

Annexin A7與腫瘤的關(guān)系密切，有研究發(fā)現(xiàn)，Annexin A7基因在轉(zhuǎn)移性前列腺癌及局部復發(fā)的激素不敏感的前列腺癌中表達顯著下調(diào)[10]。而在大多數(shù)良性前列腺組織、高度前列腺上皮內(nèi)瘤變以及前列腺癌T2和T3/4期中表達均上調(diào)；腫瘤組織中高水平的Annexin A7與乳腺癌強侵襲力、轉(zhuǎn)移力正相關(guān)，而與生存率間高度負相關(guān)[11]。轉(zhuǎn)移性乳腺癌中Annexin A7表達顯著上調(diào)；Annexin A7的表達與多形性惡性膠質(zhì)瘤生存期相關(guān)[12]；此外，Annexin A7高表達與許多種腫瘤的侵襲性相關(guān)[9]。以上研究表明，Annexin A7的表達水平和空間分布的變化與多種類型腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移進程密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Annexin A7表達在LMNPC中高于NPC，NPC中高于對照組，差異有顯著性意義，說明Annexin A7表達與NPC分化及轉(zhuǎn)移有關(guān)。Annexin A7表達還與組織分化程度、局部轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，而與年齡，性別無關(guān)。Annexin A7表達越高，傾向于分化越差、更容易發(fā)生局部和遠處轉(zhuǎn)移、容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后較差。Annexin A7可作為臨床上NPC預后及診斷的分子標記物。

以免疫組化法研究Annexin A7蛋白表達與鼻咽癌CT表現(xiàn)之間的關(guān)系，國內(nèi)尚未見報道。Annexin A7表達與CT征象中的侵及后鼻孔、侵及口咽部、顱底骨質(zhì)破壞及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明Annexin A7蛋白表達增加時，NPC更易向深部軟組織間隙和顱底侵犯，其原因可能與Annexin A7調(diào)控細胞骨架和細胞外基質(zhì)的功能有關(guān)。

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