納米羥基磷灰石/殼聚糖載藥微球的制備及性能

李湘南，陳曉明，彭志明，李世普

（1. 武漢理工大學(xué) 生物材料與工程研究中心，湖北 武漢，430070；2. 武漢理工大學(xué) 化工學(xué)院，湖北 武漢，430070）

納米羥基磷灰石/殼聚糖載藥微球的制備及性能

李湘南1,2，陳曉明1，彭志明1，李世普1

（1. 武漢理工大學(xué) 生物材料與工程研究中心，湖北 武漢，430070；2. 武漢理工大學(xué) 化工學(xué)院，湖北 武漢，430070）

以納米羥基磷灰石和殼聚糖為基質(zhì)，構(gòu)建一種新型甲硝唑緩釋微球，作為充填材料用于骨修復(fù)。利用乙醇為反應(yīng)溶劑，聚丙烯酸為分散劑，在pH=11的條件下，制備針狀納米羥基磷灰石。采用W/O 型反相乳化?交聯(lián)技術(shù)制備羥基磷灰石/殼聚糖載甲硝唑復(fù)合微球。通過紫外分光光度法測定甲硝唑含量和體外累積釋放度。研究結(jié)果表明：制得的羥基磷灰石/殼聚糖載藥復(fù)合微球粒徑主要集中在1～10 μm，殼聚糖對羥基磷灰石和甲硝唑形成了很好的包覆。復(fù)合微球平均載藥量為38.23%，平均包封率為54.21%，3 d內(nèi)對甲硝唑的釋放達(dá)到82%左右。所制備的羥基磷灰石/殼聚糖載藥復(fù)合微球形態(tài)圓整，粒徑分布較為均勻，對甲硝唑具有較好的緩釋效果。

緩釋微球；甲硝唑；納米羥基磷灰石；殼聚糖

甲硝唑具有廣譜抗厭氧菌和抗原蟲的作用，早在1978年就被世界衛(wèi)生組織選定為抗厭氧菌的基本藥物，臨床主要用于預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、腹腔及盆膿感染，皮膚軟組織、骨和骨關(guān)節(jié)等部位的感染以及脆弱擬桿菌引起的心內(nèi)膜炎、敗血癥及腦膜炎等，此外，還廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療口腔厭氧菌感染[1]。羥基磷酸鈣是脊椎動物的骨組織的主要無機成分，人工合成羥基磷灰石（HAP）的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與其基本相同，無毒副作用，無刺激性，動物實驗和臨床觀察都證明該材料是一種生物相容性極好的骨代用品，具有骨引導(dǎo)作用，填入骨缺損部位后能為骨基質(zhì)的沉積和維持提供一個良好的骨床，引導(dǎo)周圍骨組織增生，加快成骨過程，為新骨的改建創(chuàng)造了良好條件，從而促進(jìn)缺損骨的愈合[2?6]。但HAP 降解速度慢，顆粒之間無黏著性，凝固緩慢，無論充填拔牙窩、骨腔，還是用于骨組織支架材料等都會出現(xiàn)HAP顆粒外溢和難以保持外形的情況[7]。殼聚糖（CS）即羧甲基脫乙酰殼多糖來源方便，易提取，是自然界少見的帶正電荷的高分子聚合物，無毒性，無刺激性，不致敏，不與體液發(fā)生反應(yīng)并可被機體的溶解酶生物降解，具有良好的生物相容性和獨特的生物學(xué)活性，并有促進(jìn)傷口愈合、骨形成等功能，可被人體吸收利用；殼聚糖具有一定黏度，能改善混合物的流動性和劑型，有消炎止痛和促進(jìn)傷口愈合作用[8?9]。羥基磷灰石與殼聚糖復(fù)合作為組織工程材料的報道很多，但多為粉體材料或塊狀材料[10?13]。有研究表明：顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)是影響顆粒在人體內(nèi)活性的主要因素，形狀不規(guī)則的載藥顆粒植入人體會產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，因此，形狀規(guī)則的球狀載藥顆粒是植入藥物載體的首選[14?16]。本文作者用甲硝唑為主藥、HAP和殼聚糖為載體制成具有可調(diào)藥物釋放性能的羥基磷灰石/殼聚糖緩釋微球作為骨填充材料進(jìn)行局部定向釋藥，利用納米HAP的大比表面積和高表面活性裝載抗菌藥物，以及殼聚糖對藥物的包埋功能起到緩釋藥物的作用，微球材料能很好地與骨相容為一體，從而使骨缺損部位傷口愈合加快，達(dá)到骨修復(fù)的目的。

1 實驗過程

1.1 實驗材料

材料為：殼聚糖粉末，購自浙江玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司；脫乙酰度為92%，平均相對分子質(zhì)量為8×105，醫(yī)用級。羥基磷灰石，為實驗室自制；其他試劑均為分析純，購自國藥集團。

1.2 納米羥基磷灰石的制備及表征

將5.93 g Ca（NO3）2·4H2O加50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液150 mL配制得溶液1，將2.0 g （NH4）2HPO4加入50%乙醇溶液150 mL中，配制成溶液2。在常溫下，將溶液2滴入溶液1中，強力攪拌（轉(zhuǎn)速為1 000 r/min），并滴加微量聚丙烯酸（PAA），同時以2.0 mol/L的氨水為pH調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)pH為11.0，滴加完畢后繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h（保持室溫下進(jìn)行）；得懸浮液，靜置陳化12 h，離心后用去離子水和無水乙醇各洗3遍，離心分離后產(chǎn)物在50 ℃真空干燥。

1.3 殼聚糖/HAP復(fù)合微球的制備

采用反相乳液法制備殼聚糖/HAP復(fù)合微球。在60 mL 2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液中加入1.5 g殼聚糖粉末，攪拌溶解，按殼聚糖、羥基磷灰石質(zhì)量比為1：1稱取適量羥基磷灰石粉，與殼聚糖溶液通過超聲和磁力攪拌混合均勻后，將其傾倒入160 mL液體石蠟中，攪拌30 min后加入5 mL span80高速攪拌乳化，乳化后加入5 mL 25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）戊二醛在50 ℃水浴中交聯(lián)10 h，將得到的懸浮液抽濾，用氯仿和無水乙醇依次各洗3次，在50 ℃真空干燥得到殼聚糖/HAP復(fù)合微球。

1.4 載甲硝唑殼聚糖/HAP復(fù)合微球的制備

采用反相乳液法，按殼聚糖、羥基磷灰石和甲硝唑質(zhì)量比為1：1：1投料制備載甲硝唑殼聚糖/HAP復(fù)合微球。

1.5 微球表征

分別用X線衍射儀（XRD, D/Max-IIIA, Rigaku, Japan）和透射電鏡（TEM, JEM-2100F, JEOL, Japan）對納米羥基磷灰石樣品進(jìn)行物相分析和形貌觀察。

采用掃描電鏡（SEM, H-600 STEM/EDX PV9100, HITACHI, Japan）對空白微球和載藥微球形貌進(jìn)行觀察；EDS對載藥微球載藥前后成分變化進(jìn)行分析；采用KBr壓片法制樣；采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀（FT-IR, Nicolet Nexus 670）測定殼聚糖/HAP復(fù)合微球的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜。

1.6 載藥量和包封率測定

通過紫外分光光度計（島津UV2550紫外可見分光儀）測定甲硝唑載藥微球的載藥量和包封率。

取50 mg甲硝唑?qū)φ掌?，加適量生理鹽水溶解后，用生理鹽水定容至500 mL。精密吸取0，1.0，2.0，3.0，3.5，4.0，6.0和8.0 mL，分別加生理鹽水定容至25 mL，制成0，4，8，12，16，24和32 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以生理鹽水為空白樣，于200～800 nm范圍內(nèi)掃描，確定甲硝唑最大吸收波長，于最大吸收波長處測定吸光度，回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取微球適量充分研磨，精密稱取50 mg用生理鹽水定容至100 mL，攪拌24 h后，取其上清液3 mL，過濾后用生理鹽水定容于25 mL容量瓶中，在波長為320 nm處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出藥物質(zhì)量濃度，進(jìn)而得微球載藥量：

式中：ρ為藥物質(zhì)量濃度，mg/L；X為載藥量。

根據(jù)微球的質(zhì)量及微球的載藥量，可計算出包封率：

式中：η為包封率；M為投入的總藥量；m為微球的質(zhì)量。

1.7 體外累積釋放度測定方法

采用中國藥典溶出度測定體外累積釋放度。在6個燒杯中各裝入 200 mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，在37 ℃下以100 r/min攪拌。取微球1.2 g，分別投入6個燒杯中。每隔一定時間分別精密取樣2 mL，立即經(jīng)孔徑為0.8 μm微孔濾膜過濾，同時補加緩沖液2 mL。將取出的2 mL置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，取空白微球，進(jìn)行同法操作得對照試樣，在波長320 nm下，采用紫外分光光度法分別測定各樣品的吸光度，取平均值計算甲硝唑的體外累積釋放度。

2 實驗結(jié)果

2.1 羥基磷灰石的X線衍射分析

羥基磷灰石樣品的X線衍射圖譜如圖1所示。由圖1可見，羥基磷灰石的各衍射峰的位置都與標(biāo)準(zhǔn)卡片（JCPDS73-0293）相符，納米HAP的晶面如（002），（211），（112），（300），（202），（213）和（310）等均已出現(xiàn)特征衍射峰。其中，（002），（211）和（300）晶面的衍射峰為其主要衍射峰，說明最終產(chǎn)物主要為羥基磷灰石弱晶體。

2.2 羥基磷灰石的透射電鏡分析

羥基磷灰石粉末的透射電鏡照片如圖2所示。從圖2可以看到，制備的羥基磷灰石粒子為納米相針棒狀晶體顆粒。樣品的長徑比為3.0～4.0，平均直徑及長度分別為5 nm和100 nm左右；納米顆粒在透射電鏡下顯示了一定程度的團聚，對于短柱狀和針狀納米顆粒，團聚為網(wǎng)絡(luò)狀，粒子之間的接觸為點接觸式，屬于軟團聚，不是無法實現(xiàn)再分散的硬團聚，這些顆粒的團聚應(yīng)該是電鏡制樣過程中出現(xiàn)的。

圖1 羥基磷灰石樣品的X線衍射圖譜Fig.1 X-ray diffraction pattern of hydroxyapatite

圖2 羥基磷灰石粉末的透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 TEM image of hydroxyapatite crystals

2.3 微球的形貌

空白微球和載藥微球的掃描電鏡照片和EPS圖譜如圖3所示。從圖3可見：肉眼觀察微球呈小顆粒狀，顏色微黃，SEM下觀察微球外觀較圓整，成球性好。載藥前后微球粒徑基本沒變化，微球粒徑分布較均勻，粒徑范圍為1～10 μm?？瞻孜⑶虮砻婀饣?，載藥微球表面粗糙，有少量甲硝唑晶體沉積在微球表面。

從圖3（e）可見：C和O波峰較大，而Ca和P波峰較小。這表明空白微球中CS網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對HAP形成了良好的包埋，只有極小部分HAP分布在微球表層。從圖3（f）可見：出現(xiàn)了弱的N峰，Ca和P峰面積增加，這表明微球中已成功載入了甲硝唑，由于甲硝唑引入的N元素含量較少，在EDS譜圖中出現(xiàn)的N峰也較小，同時，載藥微球原料配比中殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小，對HAP的包埋能力下降，使分布在微球表層HAP的含量增加，從而使Ca和P峰面積增加。

2.4 復(fù)合微球的紅外分析

純CS，HAP和復(fù)合微球的FTIR圖譜如圖4所示。從圖4可見：CS的紅外圖譜中1 649 cm?1處的吸收峰為酰胺的酰胺Ⅰ帶吸收（即C=O的伸縮振動吸收），1 599 cm?1處的肩峰則為胺基的彎曲振動吸收峰（即酰胺Ⅱ譜帶），而在3 450 cm?1附近出現(xiàn)的吸收峰歸屬為O—H及—NH2的N—H伸縮振動吸收峰。

羥基磷灰石的紅外圖譜中474，571，601，962和1 032～1 087 cm?1處都存在明顯的吸收峰，對應(yīng)于水的吸收帶在1 634和3 000～3 700 cm?1處，表征羥基磷灰石生成的OH?吸收峰在630和3 570 cm?1處出現(xiàn)。

圖3 微球掃描電鏡照片及EDS圖譜Fig.3 SEM images and EDS spectra of microspheres

HAP和CS在復(fù)合前后沒有發(fā)生明顯變化，在3 450 cm?1處附近的O—H和N—H伸縮峰變寬，并向高波移動，說明復(fù)合材料中CS分子與HAP分子間有很強的相互作用。受HAP的影響，復(fù)合微球紅外圖譜中的酰胺Ⅰ帶發(fā)生了紅移現(xiàn)象，1 599 cm?1處的肩峰與酰胺Ⅰ帶（1 649 cm?1處）分開，可能是CS的—NH2與HAP中的—OH之間形成了氫鍵作用或者是細(xì)小的HAP顆粒進(jìn)入了CS的分子鏈間破壞了鏈間氫鍵作用而致。所以，復(fù)合微球中同時出現(xiàn)了CS與HAP的特征吸收峰，說明復(fù)合微球存在HAP和CS成分。

2.5 載藥量和包封率

甲哨唑紫外吸收曲線和數(shù)據(jù)回歸曲線如圖5所示。從圖5可見：甲硝唑于320 nm處有最大吸收，在320 nm處測定數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.051 68x?0.020 80 （x為質(zhì)量濃度，mg/L），相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，該曲線線性范圍為0～32 mg/L。

制備3批復(fù)合微球進(jìn)行測試，計算得到平均載藥量為38.23%，平均包封率為54.21%。

2.6 載藥微球的體外釋藥性能

載藥微球的累積釋放曲線如圖6所示。由圖6可知：載藥微球在 0～72 h內(nèi)體外累積釋放度逐漸遞增，10 h時體外累積釋放度為21.02%，35 h時為60%， 55 h時達(dá)到80%，隨后趨于平緩。這顯示本研究所得緩釋微球?qū)紫踹蚓哂休^好的緩釋效果，55 h左右時達(dá)到最大釋放，復(fù)合微球在3 d內(nèi)的體外累積釋藥分?jǐn)?shù)為0.826 5，釋藥平穩(wěn)。

圖4 純CS、純HAP和復(fù)合微球的FTIR圖譜Fig.4 Fourier transform infrared spectra of CS, HAP and HAP/CS microspheres

圖5 甲硝唑紫外吸收曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 UV spectrum of metronidazole and standard curve

圖6 甲硝唑-羥基磷灰石/殼聚糖載藥微球的累積釋放曲線Fig.6 Cumulative release curve of metronidazole-loaded HAP/CS composite microspheres

3 討論

本實驗采用了反相乳液－交聯(lián)法，利用納米羥基磷灰石的巨大表面積和殼聚糖的包埋功能制備了載甲硝唑的復(fù)合微球，得到的微球粒徑較均一，分散性較好。制得的微球作為骨修復(fù)組織工程材料使用時，由于微球的平均直徑為8 μm左右，體積較小，可以以注入的方式治療，是一種較為理想的骨修復(fù)材料。

有機?無機微球是近些年骨修復(fù)材料及藥物新劑型研究的一個熱點。這是因為有機?無機復(fù)合微球既具有有機材料的可塑性、易加工性以及生物兼容性，又具備無機物的剛性、骨引導(dǎo)活性等性能；同時，可實現(xiàn)對藥物的控制釋放。

在實驗中，用50%乙醇為反應(yīng)溶劑，當(dāng)初始溶液pH等于11時，樣品都呈針棒狀。樣品的平均直徑及長度分別為30 nm和100 nm，為納米級別，且分散度較高。在包埋過程中，用超聲波加快速攪拌分散在殼聚糖中，避免了羥基磷灰石的團聚。從圖3（a）可以看到：微球球形度好，沒有看到大塊的羥基磷灰石的團聚；從圖3（b）可以看到：復(fù)合微球表面較為圓整光滑，表面無塊狀物的團聚，證明羥基磷灰石納米粉末已均勻分布在殼聚糖網(wǎng)絡(luò)中，從仿生學(xué)角度出發(fā)，應(yīng)當(dāng)保持骨替代物中羥基磷灰石呈納米狀態(tài)，在制備骨修復(fù)材料時應(yīng)盡可能避免羥基磷灰石顆粒發(fā)生團聚，本實驗結(jié)果符合仿生學(xué)原理。

在微球中加入甲硝唑，可以預(yù)防感染，同時因為藥物在高分子載體中，還可以起到緩釋的效果。在微球載藥量的測定中，0.1 g空白微球可以裝載甲硝唑54.21 mg，其載藥量為38.23%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），從圖6可知：甲硝唑在72 h內(nèi)都可以保持有效濃度。

在臨床骨創(chuàng)傷的實例中，由于傷口附近的血液循環(huán)系統(tǒng)被破壞，常伴隨著傷口的感染；為了治療或預(yù)防這種感染，常常要注射一些抗生素藥物。很多藥物無法直接使用，或者直接使用效果不明顯，需要用高分子材料或無機多孔空心來包埋藥物，并通過合理地設(shè)計微球尺寸、表面性質(zhì)、緩釋性能等來達(dá)到在所需的時間、所需的地點以及所需的速度釋放出藥物。

4 結(jié)論

（1） 采用反相乳液?交聯(lián)法制備的羥基磷灰石/殼聚糖載藥微球形態(tài)均勻一致，均為圓球狀，粒徑分布窄，再分散性較好。

（2） 復(fù)合微球?qū)紫踹虻钠骄d藥量為38.23%，平均包封率為54.21%，該載藥微球釋藥平穩(wěn)，55 h左右時達(dá)到最大釋放，3 d釋藥后的甲硝唑體外累積釋藥分?jǐn)?shù)達(dá)到0.826 5。表明該微球?qū)紫踹蚓哂休^好的載藥和緩釋性能，可用于進(jìn)一步骨修復(fù)實驗研究。

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（編輯 趙?。?/p>

Preparation and performance of drug-loaded nano-hydroxyapatite/chitosan microspheres

LI Xiang-nan1,2, CHEN Xiao-ming1, PENG Zhi-ming1, LI Shi-pu1

（1. Biomedical Materials and Engineering Research Center, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China; 2. College of Chemical Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China）

Nano-hydroxyapatite and chitosan were selected as matrix to prepare a novel metronidazole sustained release microsphere for bone tissue recovery. Aciform nano-hydroxyapatite was synthesized in ethanol medium （pH=11） using polyacrylic acid as dispersant. Metronidazole-loaded chitosan/hydroxyapatite composite microspheres were prepared by water in oil emulsion cross-linking method. The results show that the size of as-fabricated composite microspheres is mainly distributed from 1 to 10 μm, and hydroxyapatite and metronidazole are embedded very well by chitosan. The average drug loading is 38.23%, the average entrapment efficiency is 54.21%, and the cumulative release rate to metronidazole is near 82% during 3 d. The composite microspheres are spherical and distributed uniformly in diameter with a good property for the slow-release of metronidazole, which have great potential in drug delivery system.

sustained release microsphere; metronidazole; nano-hydroxyapatite; chitosan

R318

A

1672?7207（2011）05?1232?06

2010?01?25；

2010?05?20

國家自然科學(xué)基金資助項目（50872099）

李湘南（1977?），女，湖南平江人，博士研究生，從事生物材料研究；電話：15327392976；E-mail： xiangnanlidong@163.com