SDF-1/CXCR4生物學軸在乳腺癌中的表達及其臨床意義

宦大為，惠林萍，滕猛，王巧歡，張文竹，張弘

（1.沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院病理科，沈陽 110024；2.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室，沈陽 110001；3.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院中心實驗室，沈陽 110032）

SDF-1/CXCR4生物學軸在乳腺癌中的表達及其臨床意義

宦大為1，2，惠林萍3，滕猛1，王巧歡2，張文竹2，張弘2

（1.沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院病理科，沈陽 110024；2.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室，沈陽 110001；3.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院中心實驗室，沈陽 110032）

目的檢測趨化因子基質細胞衍生因子1（SDF-1）及其受體CXCR4在乳腺浸潤癌、導管原位癌及癌旁組織中的表達，分析兩者與乳腺浸潤癌臨床病理學特征的關系，探討SDF-1/CXCR4生物學軸在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的的作用。方法 采用免疫組化方法檢測80例乳腺浸潤癌、15例導管原位癌和15例癌旁組織中SDF-1及CXCR4蛋白的表達。應用RT-PCR檢測40例乳腺浸潤癌、5例導管原位癌和5例癌旁組織中SDF-1及CXCR4mRNA的表達。結果 免疫組化檢測結果顯示，SDF-1、CXCR4在乳腺浸潤癌與導管原位癌，導管原位癌與癌旁組織中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中CXCR4表達與乳腺癌的淋巴結轉移和分期有關（P＜0.05）。RT-PCR檢測結果顯示，SDF-1與CXCR4mRNA在乳腺浸潤癌與導管原位癌，導管原位癌與癌旁組織中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA在乳腺浸潤癌中的表達呈正相關（P＜0.05）。結論SDF-1/CXCR4生物學軸在促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移過程中起促進作用。

SDF-1/CXCR4生物學軸；乳腺癌；免疫組化；RT-PCR

SDF-1/CXCR4生物學軸是指由趨化因子基質細胞衍生因子 1（stromal-derived factor-1，SDF-1）及其特異性受體CXC趨化因子受體4（c-x-c chemokine receptor 4，CXCR4）相互作用而構成的一個與細胞間信號轉導、細胞遷移有密切關系的耦聯(lián)分子對，廣泛地表達于多種細胞和組織中。SDF-1/CXCR4生物學軸參與包括引起腫瘤細胞產生趨化運動在內的多種病理生理過程，而腫瘤細胞的趨化運動與腫瘤的侵襲轉移存在密切關系。腫瘤細胞的定向運動是腫瘤浸潤轉移的重要過程，研究顯示，SDF-1/CXCR4生物學軸的激活在乳腺癌向特定組織器官轉移的過程中起關鍵作用［1］，但聯(lián)合檢測SDF-1與CXCR4在乳腺癌中的表達，從蛋白及mRNA水平探討二者在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同作用方面的研究較少。因此，本研究聯(lián)合檢測了SDF-1、CXCR4在乳腺浸潤癌、導管原位癌及癌旁組織中的表達，旨在明確SDF-1/CXCR4生物學軸在乳腺癌生長、浸潤、轉移中的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源：免疫組化標本取自沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院病理科2002年9月至2007年9月手術切除的石蠟標本，包括乳腺浸潤癌標本80例，乳腺導管原位癌標本15例，乳腺癌癌旁組織15例（取自距腫瘤邊緣5cm的非癌乳腺組織）。乳腺浸潤癌按WHO（2003）乳腺腫瘤分類進行分型：浸潤性導管癌61例，浸潤性小葉癌5例，髓樣癌4例，神經內分泌癌4例，浸潤性微乳頭狀癌2例，黏液癌2例，化生性癌1例，大汗腺癌1例。對61例浸潤性導管癌進行組織學分級：I級8例，Ⅱ級41例，Ⅲ級12例。按照UICC對全部乳腺浸潤癌進行病理分期：I期13例，Ⅱ期42例，Ⅲ期25例。標本經10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋保存?；颊呔鶠榕裕挲g30～84歲，平均年齡53歲。

RT-PCR標本取自沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院病理科2006年9月至2007年12月手術切除的新鮮標本，包括乳腺浸潤癌標本40例，乳腺導管原位癌標本5例，乳腺癌癌旁組織5例（取自距腫瘤邊緣5cm的非癌乳腺組織）。乳腺浸潤癌按WHO（2003）乳腺腫瘤分類分型：浸潤性導管癌29例，浸潤性小葉癌3例，髓樣癌4例，黏液癌2例，浸潤性微乳頭狀癌1例，化生性癌1例。新鮮組織在切除術后立即置于-80℃保存?；颊呔鶠榕裕挲g30～80歲，平均年齡54歲。

1.1.2 試劑：兔抗人SDF-1及CXCR4多克隆抗體濃縮型（武漢博士德生物工程有限公司），SP法免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術開發(fā)有限公司）。RNAiso Plus、瓊脂糖（大連Takara公司），TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR Mix（北京天根公司），Trans DNA MarkerⅠ（北京全式金公司）。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學：采用SP法，具體操作按照說明書進行。SDF-1和CXCR4抗體均按1︰100倍稀釋；PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性切片做陽性對照；4℃過夜；AEC顯色5～10min；蘇木素復染；AEC封片膠及中性樹膠封片。結果判斷：SDF-1、CXCR4陽性著色均主要分布于細胞質，染色呈黃色至紅色；采用雙評分半定量法進行評分，高倍鏡下根據(jù)染色強度和陽性細胞所占百分比例判定；染色強度評分標準：不著色0分，黃色1分，桔黃色2分，紅色3分。陽性細胞所占比例評定標準：陽性細胞率<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。兩種評分相加，0～1分為陰性（－），2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.2.2 RT-PCR：總RNA提取過程嚴格按照RNAiso Plus試劑說明書進行?？俁NA純度和濃度使用紫外分光光度計（NanoPhotometer，Germany）測定，經測定所用樣品的A260/A280比值都在1.8～2.0之間。反轉錄過程也按試劑說明書進行操作。引物序列分別為：CXCR4上游引物為 5′AAAATCTTCCTGCCCACC 3′，下游引物為 5′GCCAACATAGACCACCTT 3′；SDF-1上游引物為 5′GCTTTGAGTGACTGGGTT 3′，下游引物為 5′GTGGCAAGATGATGGTTT 3′；內參GAPDH上游引物為 5'GAAGGTCGGAGTCAACGGAT 3'，下游引物為 5'CCTGGAAGATGGTGATGGG 3'。PCR循環(huán)條件為：94℃預變性3min，94℃ 變性 30s，59.5℃（CXCR4）、56.5℃（SDF-1）、58.5℃（GAPDH）退火 30s，72℃ 延伸 1min，35個循環(huán)后于72℃ 延伸5min。PCR反應產物的大小分別為 366bp（CXCR4）、124bp（SDF-1） 和 224bp（GAPDH），PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。使用紫外光凝膠照像，經Image J軟件進行灰度測定，實驗重復3次。將CXCR4和SDF-1的灰度值與GAPDH灰度值的比值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，用χ2檢驗對SDF-1、CXCR4在浸潤性乳腺癌、導管原位癌及癌旁組織中的表達結果進行分析；用Spearman相關檢驗對SDF-1、CXCR4在浸潤性乳腺癌中表達的相關性進行分析；用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗和非參數(shù)Kruskal Wallis Test檢驗對SDF-1、CXCR4表達與乳腺浸潤癌臨床病理學特征的相關性進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化

2.1.1 SDF-1、CXCR4蛋白在乳腺浸潤癌、導管原位癌及癌旁組織中的表達：SDF-1、CXCR4免疫組化陽性產物主要定位于細胞質內。在乳腺癌旁組織、導管原位癌和乳腺浸潤性癌中，SDF-1陽性表達率分別為 33.33%，53.33%，87.50%（圖 1）；CXCR4分別為20.00%，53.33%，80.00%（圖2）。兩者在癌旁組織、浸潤癌的陽性表達率與導管原位癌相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），伴隨病變進展過程均有表達增高的趨勢。見表1。

表1癌旁組織、導管原位癌與乳腺浸潤癌S D F-1與C X C R 4免疫組化結果T a b.1T h e e x p r e s s i o n o f S D F-1a n d C X C R 4p r o t e i n i n a d j a c e n t t i s s u e s，d u c t a l c a r c i n o ma i n s i t u a n d b r e a s t c a r c i n o ma++ +++ - + ++ +++Adjacent tissues 15 10 5 0 0 12 3 0 0Ductal carcinoma in situ 15 7 7 1 0 7 7 1 0Breast carcinoma 80 10 32 36 2 16 39 24 1Group n SDF-1 CXCR4-+

2.1.2 SDF-1、CXCR4蛋白在乳腺浸潤癌中表達相關：相關性分析結果發(fā)現(xiàn)，SDF-1與CXCR4蛋白在乳腺浸潤癌中的表達呈正相關（P＜0.05），見表2。

2.1.3 SDF-1、CXCR4蛋白的表達與乳腺癌臨床病理學特征的關系：組間差異比較結果顯示，CXCR4的表達與入組乳腺浸潤癌患者的年齡和腫瘤的直徑、組織學分級及癌的類型無關，而與淋巴結轉移、臨床分期有關（P＜0.05），且隨著淋巴結轉移數(shù)目的增多，臨床分期的增高，表達陽性率也逐漸提高，見表3。SDF-1與上述臨床病理學特征均無關，見表4。

表2S D F-1、C X C R 4在乳腺浸潤癌中的表達的相關性分析T a b.2T h e c o r r e l a t i o n o f S D F-1a n d C X C R 4e x p r e s s i o n s i n b r e a s t c a r c i n o ma SDF－1-+ ++ +++- 8 6 2 0 0.368 ＜0.05+ 1 18 20 0++ 1 8 13 2+++ 0 0 1 0CXCR4r P表3C X C R 4與乳腺癌臨床病理學特征的關系T a b.3T h e c o r r e l a t i o n o f C X C R 4p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d t h e c l i n i c o p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s o f b r e a s t c a r c i n o ma CXCR4-+++ +++Age（year）Characteristic n Z χ2 P-0.011 0.992<53 46 9 23 13 1≥53 34 7 16 11 0Diameter of tumor（cm）0.897 0.638＜2 21 4 11 6 02～5 44 9 23 11 1≥5 15 3 5 7 0Histological grade﹡3.311 0.191Ⅰ8242 0Ⅱ41 7 22 11 1Ⅲ12 1 4 7 0TNM stage 11.314 0.003Ⅰ13 3 7 3 0Ⅱ42 13 20 8 1Ⅲ25 0 12 13 0Lymph node metastasis（n）11.019 0.012046 14 22 9 11～3 13 2 7 4 04～9 16 0 9 7 0＞9 5 0 1 4 0Histological type-1.527 0.127Ductal carcinoma 61 10 30 20 1Others 19 6 9 4 0*Only 61cases of invasive ductal carcinoma were analyzed.

表4S D F-1與乳腺癌臨床病理學特征的關系T a b.4T h e c o r r e l a t i o n o f S D F-1p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d t h e c l i n i c o p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s o f b r e a s t c a r c i n o ma+ ++ +++Age（year）Characteristic n SDF-1-Z χ2 P-0.551 0.581<53 46 6 20 18 2≥53 34 4 12 18 0Diameter of tumor（cm）0.670 0.715＜2 21 2 8 11 02～5 44 6 19 18 1≥5 15 2 5 7 1Histological grade﹡3.630 0.163Ⅰ8 2 4 2 0Ⅱ41 3 17 21 0Ⅲ12 1 4 5 2TNM stage 4.125 0.127Ⅰ13 2 6 5 0Ⅱ42 8 16 17 1Ⅲ25 0 10 14 1Lymph node metastasis（n）5.200 0.158046 9 19 17 11～3 13 1 3 9 04～9 16 0 8 8 0＞9 5 0 2 2 1Histological type-0.960 0.337Ductal carcinoma 61 6 25 28 2Others 19 4 7 8 0*Only 61cases of invasive ductal carcinoma were analyzed.

2.2 RT-PCR

2.2.1 SDF-1、CXCR4mRNA在乳腺浸潤癌、導管原位癌及癌旁組織中的表達（圖3）：RT-PCR結果顯示，癌組織中SDF-1表達較強，癌旁組織中表達水平很低，在原位癌中僅有少量表達。CXCR4mRNA在乳腺浸潤癌中呈高表達，癌旁組織中表達水平低，在原位癌中呈低表達。SDF-1與CXCR4mRNA在癌旁組織與導管原位癌、導管原位癌與浸潤癌中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），伴隨病變進展過程均有mRNA表達水平增高趨勢，見表5。

表5癌旁、導管原位癌與乳腺浸潤癌S D F-1、C X C R 4mR N A表達T a b.5T h e mR N Ae x p r e s s i o n o fS D F-1，C X C R 4i n a d j a c e n t t i s s u e s，d u c t a l c a r c i n o ma i n s i t u a n d b r e a s t c a r c i n o ma SDF-1 CXCR4Mean SD P Mean SD P Adjacent tissues 5 0.454 0.072 0.520 0.054Ductal carcinoma in situ 5 0.804 0.300 ＜0.051） 0.759 0.213 ＜0.051）Breast carcinoma 40 1.151 0.374 ＜0.052） 0.924 0.322 ＜0.052）1）compared to adjacent tissues；2）compared to ductal carcinoma in situ.Group n

2.2.2 乳腺浸潤癌中SDF-1、CXCR4mRNA表達的相關性：SDF-1、CXCR4mRNA在乳腺浸潤癌中表達的相關性分析發(fā)現(xiàn)，SDF-1與CXCR4的表達水平呈正相關（P＜0.05），見表6。

表6乳腺浸潤癌中S D F-1、C X C R 4mR N A表達的相關性T a b.6T h e c o r r e l a t i o n o fS D F-1a n dC X C R 4i n b r e a s t c a r c i n o ma Gene Mean SD r P CXCR4 1.151 0.374 0.555 ＜0.05SDF-1 0.924 0.322

3 討論

腫瘤細胞在實現(xiàn)侵襲、轉移這一復雜的病理過程中，離不開癌細胞向特定組織器官的趨化和定向移動。研究顯示，SDF-1與其唯一受體CXCR4的結合激活了一系列細胞間信號轉導通路和效應分子，從而調節(jié)細胞的存活、增殖、趨化、遷徙和黏附［2］。目前已發(fā)現(xiàn)CXCR4在23種不同類型的腫瘤中均有表達，是腫瘤細胞表達最為普遍的趨化因子受體，并且與患者的預后相關［3］。Kang等［4］通過檢測 120例乳腺癌組織中CXCR4的表達發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達陽性與患者淋巴結轉移相關；Li等［5］發(fā)現(xiàn)，高表達CXCR4的乳腺癌患者預后較差。研究表明，下調CXCR4的表達也可以明顯抑制結腸癌［6］和前列腺癌［7］的遠處轉移。上述研究均提示，SDF-1/CXCR4生物學軸在腫瘤侵襲轉移過程中起著非常重要的作用。

本研究中免疫組化及RT-PCR結果表明，SDF-1及其受體CXCR4的蛋白及mRNA在乳腺浸潤癌與導管原位癌、導管原位癌與癌旁組織中的表達差異均有統(tǒng)計學意義，伴隨病變進展兩者均有表達增高趨勢。同時，本研究結果顯示，在乳腺浸潤癌中，SDF-1與CXCR4mRNA的表達水平呈正相關。提示這一對受體配體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移過程中起重要作用。

研究顯示，原發(fā)腫瘤的間質細胞是SDF-1的重要資源，Allinen等［8］隔離正常乳腺組織和浸潤性乳腺癌標本中的上皮細胞和間質細胞，綜合分析不同細胞的基因表達時發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織比較，SDF-1在間質細胞中的與浸潤性乳腺癌相關的肌纖維母細胞的表達顯著上調。Orimo等［9］發(fā)現(xiàn)，乳腺腫瘤間質肌纖維母細胞產生的SDF-1明顯多于乳腺癌細胞或正常乳腺上皮細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4的表達與乳腺癌淋巴結轉移和臨床分期相關，而SDF-1與上述臨床病理學特征均無相關性。Allinen和Orimo的研究為本研究SDF-1/CXCR4生物學軸中SDF-1在乳腺癌上皮細胞內表達與臨床病理學特征均無相關性提供了一定的理論支持，這也說明CXCR4在乳腺癌癌細胞中的表達比SDF-1更能體現(xiàn)該生物學軸與乳腺癌臨床病理學特征的相關性。綜上所述，本研究從蛋白及mRNA水平證實了SDF-1/CXCR4生物學軸激活可以促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展乃至侵襲和轉移。

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（編輯王又冬，英文編輯鄭華川）

The Expression and Clinical Significance of the SDF-1/CXCR4Biological Axis in Breast Cancer

HUAN Da-wei1，2，HUI Lin-ping3，TENG Meng1，WANG Qiao-huan2，ZHANG Wen-zhu2，ZHANG Hong2
（1.Department of Pathology，Shenyang Fengtian Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；2.Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Central Laboratory，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo analyze the clinicopathological significance of ligand SDF-1and its receptor CXCR4expression in breast carcinoma，ductal carcinoma in situ and adjacent tissues and clarify the roles of SDF-1/CXCR4biological axis in the pathogenesis of breast cancer.MethodsSDF-1and CXCR4protein expression were examined in 80cases of breast carcinoma，15cases of ductal carcinoma in situ and 15cases of adjacent tissue by immunohistochemistry.SDF-1andCXCR4mRNA expression were determined in 40cases of breast invasive carcinoma，5cases of ductal carcinoma in situ and 5cases of normal tissue adjacent to cancer tissues by RT-PCR.ResultsThe protein and mRNA expressions ofSDF-1andCXCR4were different in breast carcinoma and ductal carcinoma in situ，ductal carcinoma in situ and adjacent tissues（P<0.05）.The expression of CXCR4protein was related to lymph node metastasis and breast cancer stage （P<0.05）.Both protein and mRNA expression of SDF-1and CXCR4were positively correlated in breast carcinoma （P<0.05）.ConclusionSDF-1/CXCR4biological axis might play an important role in promoting breast cancer growth and metastasis.

SDF-1/CXCR4biological axis；breast carcinoma；immunohistochemistry；RT-PCR

R737.9

A

0258-4646（2011）02-0166-06

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0954.018

宦大為（1971-），男，副主任醫(yī)師，碩士.

張弘，E-mail：zhho2@163.com

2010-09-16