辛伐他汀對細(xì)菌脂多糖共孵育內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

邢金燕，徐敏，陳玉國，王素華，苑志勇

（1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院急診科，濟(jì)南 250012；2.勝利油田中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 東營 257000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266003）

辛伐他汀對細(xì)菌脂多糖共孵育內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

邢金燕1，徐敏2，陳玉國1，王素華3，苑志勇3

（1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院急診科，濟(jì)南 250012；2.勝利油田中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 東營 257000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266003）

目的觀察不同濃度辛伐他汀對與細(xì)菌脂多糖（LPS）共孵育人內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖、遷移、黏附功能的影響。方法 采用密度梯度離心法從成人外周靜脈血獲取單個核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被培養(yǎng)板上，培養(yǎng)7d，收集貼壁細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡鑒定為正在分化的EPCs。EPCs傳代培養(yǎng)3d，消化搜集貼壁細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至105/ml，將等量EPCs接種到96孔培養(yǎng)板上，隨機(jī)分為5組：（1）空白對照組，EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)48h。（2）LPS孵育組，GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液與LPS液（100ng/mL）共同培養(yǎng)48h。（3）辛伐他汀干預(yù)組：GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液與LPS液培養(yǎng)24h，細(xì)胞換液，后分別加入0.1μmol/L（simv 0.1組）、1.0μmol/L（simv 1.0組）、10.0μmol/L（simv 10.0組）不同濃度辛伐他汀液培養(yǎng) 24h。應(yīng)用 MTT 比色法、改良的Boyden小室觀察其增殖、遷移、黏附功能。結(jié)果 人EPCs與LPS共孵育后其增殖顯著降低（P=0.009），黏附、遷移能力有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.279，P=0.056）。加入不同濃度辛伐他汀后EPCs的增殖、遷移和黏附能力不同程度改善，隨辛伐他汀濃度增加，該作用增強(qiáng)，辛伐他汀濃度為0.1μmol/L增殖、黏附、遷移功能較LPS組均改善，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P分別為0.687、0.501、0.683）、濃度為 1.0μmol/L 時，EPCs增殖顯著改善（P=0.017），濃度 10.0μmol/L 時 EPCs增殖、黏附、遷移功能，較 LPS 組均顯著改善（P分別為0.00，0.002，0.00），其中黏附和遷移功能較對照顯著改善（P=0.039，P=0.000）。結(jié)論LPS可使EPCs增殖功能顯著降低，黏附和遷移能力有所下降。辛伐他汀可以改善LPS導(dǎo)致的EPCs增殖、黏附、遷移功能的降低，在研究范圍內(nèi)改善作用隨濃度增加而增強(qiáng)。

他??；內(nèi)皮祖細(xì)胞；增殖；遷移；黏附

膿毒癥（sepsis）是繼發(fā)于感染的全身炎性反應(yīng)綜合征，目前研究認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)異常在膿毒癥的病情進(jìn)展中起重要作用［1］。1997年，Asahara等［2］首次證明循環(huán)外周血中存在具有在體內(nèi)外增殖、遷徙和分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力的前體細(xì)胞，并將其命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）。EPC可以在體內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞（endothelium cells，ECs），是參與出生后生理性及病理性血管形成最主要的細(xì)胞。膿毒癥患者循環(huán)EPCs數(shù)量與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)。辛伐他汀能增加EPCs的增殖、遷移、抗凋亡能力［3］。有多項研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物在膿毒癥的發(fā)生及進(jìn)展中起重要作用［4，5］，但他汀類藥物對脂多糖（LPS） 作用后EPCs的影響未見報道。本課題通過LPS與人EPCs共孵育后，加入不同濃度辛伐他汀，在細(xì)胞水平觀察辛伐他汀及LPS對EPCs增殖、遷移、黏附功能的影響，探討他汀類藥物對LPS孵育后內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 EPCs提取

實驗血液樣本來自健康志愿者，密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞，將單個核細(xì)胞鋪在包被有人纖維連接蛋白（Roche公司，德國）的培養(yǎng)板上。應(yīng)用EGM-2MV（LONZA公司，瑞士）培養(yǎng)4d，用PBS洗除非貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至7d，再加PBS洗除非貼壁細(xì)胞，取貼壁細(xì)胞供實驗用。

1.2 EPCs鑒定

細(xì)胞與 DiI-acLDL（2.4μg/ml）（Biomedical公司，美國）37℃下孵育1h以檢測EPCs對DiI-acLDL的攝取。然后用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10min，固定后用 PBS 浸洗，將 FITC-UEA-I（10μg/ml）（Vector公司，美國）加于上述標(biāo)本37℃下孵育1h。在激光共聚焦顯微鏡下（LSCM，Zeiss公司，德國）UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

1.3 實驗分組

貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為5組：（1）空白對照組，EGM-2MV 標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng) 48h；（2）LPS孵育組，GM-2MV 標(biāo)準(zhǔn)液與 LPS 液（100ng/mL）共同培養(yǎng) 48h；（3）辛伐他汀干預(yù)組，根據(jù)辛伐他汀濃度不同分為3個組：GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液與LPS液培養(yǎng)24h，細(xì)胞換液后分別加入 0.1μmol/L（simv 0.1組）、1.0μmol/L（simv 1.0組）、10.0μmol/L（simv 10.0組）3種不同濃度辛伐他汀液培養(yǎng)24h。

1.4 增殖功能檢測

EPCs傳代培養(yǎng)3d后，用0.25%胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，1500r/min離心4min，棄上清，懸浮于EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液，吹打混勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至105/ml。將等量EPCs接種到96孔培養(yǎng)板上，設(shè)每列為1組，共5組，每組設(shè)6個復(fù)孔（每孔加100μl），培養(yǎng)24h。棄上清，再加入EGM-2MV饑餓液，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化。棄上清，分別按上述分組方案向每組加入相應(yīng)試劑。48h后加入MTT液10μl，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4h，棄上清，向每孔加入DMSO（二甲基亞砜液）150μl，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀于波長490nm處測OD值。

1.5 遷移功能檢測

EPCs傳代培養(yǎng)3d后，用0.25%胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，1500r/min離心4min，棄上液，用前述EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液吹打混勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106/ml。每下室按前述分組加入600μl相應(yīng)試劑，共5組，每組設(shè)6個復(fù)孔，上室與下室之間隔以8.0μm孔徑硝酸纖維膜。將等量EPCs接種到Transwell小室上室，每上室加入100μl，共30孔。48h后，用無菌棉棒擦去上室濾膜上面的未移動細(xì)胞。加入MTT液60μl至下室，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，吸棄下室上清液，向每孔加入DMSO液700μl，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀于波長490nm處測OD值。

1.6 黏附功能檢測

EPCs傳代培養(yǎng)3d后，用0.25%胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，1500r/min離心機(jī)離心4min，棄上液，用前述EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液吹打混勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至105/ml。將等量EPCs接種到12孔培養(yǎng)板中，共5孔（每孔加1ml），培養(yǎng)24h。棄上清，再加入EGM-2MV饑餓液，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化。棄上清，分別按上述分組方案向每孔加入相應(yīng)實驗試劑。48h后，用0．25%胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，分別懸浮在600μl EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液中，計數(shù)。然后將同等數(shù)目的EPCs接種在96孔板內(nèi)，每組設(shè)6個復(fù)孔，在37℃下培養(yǎng)30min。吸棄上清液，加入 MTT 液 10μl，EGM-2MV 標(biāo)準(zhǔn)液 90μl，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，吸棄上清液，向每孔加入DMSO液150μl，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀于波長490nm處測OD值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EPCs鑒定

在培養(yǎng)過程中倒置顯微鏡下觀察EPCs的形態(tài)特點，見細(xì)胞成短梭狀，成簇排列，增殖良好。用DiI-acLDL和FITC-UEA-I染色后，激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）觀察熒光表達(dá)情況，UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs，隨機(jī)選取6個視野，分別計算兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中雙染陽性細(xì)胞的百分率，均在96%左右。

2.2 辛伐他汀與LPS對EPCs增殖的影響

僅使用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)48h，EPCs增殖的OD值為0.13533±0.01353，EPC與LPS共孵育，EPCs增殖的OD值為0.11833±0.01286，其增殖能力顯著降低（P=0.009），加入辛伐他汀后其增殖OD值較與LPS共同孵育后均有提高，辛伐他汀濃度1.0μmol/L時EPCs增殖功能較LPS組顯著提高（P=0.017）。10.0μmol/L 的辛伐他汀作用后，EPCs增殖能力較LPS組顯著改善（P=0.000），較空白對照組有改善，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.241），見表1。

2.3 辛伐他汀與LPS對EPCs遷移的影響

僅使用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)的對照組，EPCs遷移的OD值為0.0885±0.0120，LPS作用后EPCs遷移OD值降低（P=0.026），應(yīng)用不同濃度辛伐他汀共孵育后，EPCs遷移水平逐漸改善，0.1μmol/L時對照組無差異（P=0.683），加用 1.0μmol/L 辛伐他汀后EPCs遷移功能較LPS組改善，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.069），10.0μmol/L 辛伐他汀作用后，EPCs遷移能力較對照組和LPS組均顯著改善作用（P=0.000，P=0.000），見表 1。

2.4 辛伐他汀與LPS對EPCs黏附的影響

與使用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)的對照組比較，EPCs黏附OD值在LPS作用后有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.279），與辛伐他汀作用后，呈現(xiàn)濃度依賴性變化，0.1μmol/L、1.0μmol/L 辛伐他汀作用后EPCs黏附能力與LPS組比較有改善，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.505，P=0.064），10.0μmol/L 辛伐他汀作用后與LPS共孵育的EPCs黏附能力顯著改善（P=0.002），與對照組比較EPCs的黏附能力也有顯著改善（P=0.039），見表 1。

表1L P S和不同濃度辛伐他汀作用下E P C s的增殖、遷移、黏附O D值（490n m）T a b.1T h eO p t i c a l d e n s i t yo f p r o l i f e r a t i o n，mi g r a t i o na n da d h e s i o no f E P C si n c u b a t e dw i t hL P Sa n d/o r s i mv a s t a t i ni n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n（490n m）Group Proliferation Migration Adhesion Control 0.1353±0.0135 0.0885±0.0120 0.0753±0.0070LPS 0.1183±0.01292） 0.0868±0.00671） 0.0697±0.0097Simv0.1 0.1208±0.00731） 0.0892±0.0091 0.0732±0.0133Simv1.0 0.1337±0.01643） 0.0943±0.0177 0.0800±0.0165Simv10.0 0.1427±0.01884） 0.0982±0.00612），4） 0.0863±0.02011），4）1）P<0.05vs control group；2）P<0.01vs control group；3）P<0.05vs LPS group；4）P<0.01vs LPS group.

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷在膿毒癥病情進(jìn)展中起重要作用，并與預(yù)后相關(guān)［6］。Chape1等［7］在2003年首次證實多能干細(xì)胞可以在機(jī)體發(fā)生MODS后向不同組織遷徙或歸巢，發(fā)揮組織修復(fù)作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞在膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)和維持內(nèi)皮完整性中起重要作用，并可能成為膿毒癥診斷和治療策略中的重要部分［8］。Rafat等［9］對危重病患者的外周血循環(huán)EPCs測定發(fā)現(xiàn)，感染患者EPCs數(shù)量較非感染患者及健康者均顯著升高，而死亡膿毒癥患者的循環(huán)EPCs水平顯著降低。Mayr等［10］對健康志愿者注射LPS，發(fā)現(xiàn)其循環(huán)EPCs顯著降低，在6h左右最低，同時測定TNF、VEGF和G-CSF水平，發(fā)現(xiàn)相互間有明確相關(guān)性，推測LPS對EPCs的作用與細(xì)胞因子作用有關(guān)。

2000年Ando等［11］首先報道事先采用他汀類藥物干預(yù)可以改善大鼠膿毒癥的生存率，后有大量研究證實他汀類藥物確實可以降低膿毒癥的患病率和發(fā)病率，但對其作用機(jī)制研究大多集中于炎性因子及其途徑，包括對于NO、凋亡路徑等影響［12］。近期研究證實循環(huán)EPCs水平與膿毒癥患者預(yù)后相關(guān)，足量的EPCs對感染損傷后組織的修復(fù)是必要的［13］。有研究通過失血性休克、復(fù)蘇、注入內(nèi)毒素制造豬MODS模型，發(fā)現(xiàn)失血性休克豬的EPC升高，在膿毒癥早期達(dá)峰值，發(fā)生MODS后持續(xù)降低，并持續(xù)至死亡，存活者的EPCs后期出現(xiàn)升高［14］。Rafat等［9］對膿毒癥患者EPCs測定，發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者EPCs顯著升高，并且存活者較死亡者EPCs數(shù)量更高，提出循環(huán)EPCs數(shù)量可以作為膿毒癥患者預(yù)后指標(biāo)。對于單純肺損傷患者也得出的相似結(jié)論，對ALI患者研究發(fā)現(xiàn)EPC高的患者有更高的28d生存率，伴膿毒癥患者近半數(shù)EPC升高［15］。近年來研究顯示他汀類藥物可以改善EPCs的增殖、遷移、抗凋亡功能［3］。但對于他汀類藥物對LPS作用后EPCs的影響未見相關(guān)報道。本實驗將EPCs與LPS共孵育后，加入不同劑量的辛伐他汀共孵育，顯示辛伐他汀可使與LPS共孵育的EPCs的降低的增殖、遷移、黏附能力改善，該作用隨辛伐他汀劑量增加而增強(qiáng)，10.0μmol/L的辛伐他汀作用后與LPS共孵育EPCs遷移和黏附功能較僅使用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)EPCs組改善，增殖功能也有改善，但無統(tǒng)計學(xué)意義；表明10.0μmol/L的辛伐他汀不僅抵消LPS對EPCs增殖、遷移和黏附能力的影響，甚至可以使其改善，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本實驗證實，單純LPS可導(dǎo)致EPCs增殖能力顯著降低，遷移和黏附能力下降；加入不同濃度辛伐他汀可不同程度逆轉(zhuǎn)該影響，0.1μmol/L的辛伐他汀作用后與LPS共孵育EPCs增殖、遷移和黏附功能基本達(dá)到單純EPCs孵育水平；10.0μmol/L的辛伐他汀作用后LPS孵育后EPCs的遷移、黏附與僅使用EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)EPCs組比較均顯著改善，增殖能力也有提高，對于其具體的作用通路有待于進(jìn)一步研究。

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（編輯裘孝琦，英文編輯王又冬）

Effects of Simvastatin on the Functions of Endothelial Progenitor Cells Incubated with Lipopolysaccharide

XING Jin-yan1，XU Min2，CHEN Yu-guo1，WANG Su-hua3，YUAN Zhi-yong3
（1.Department of Emergency，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Intensive Care Unit，The Central Hospital of Shengli Oil Field，Dongying 257000，China；3.Department of Intensive Care Unit，The Affiliated Hospital，College of Medicine，Qingdao University，Qingdao 266003，China）

ObjectiveTo investigate the effect of simvastatin at different concentration on the functions of endothelial progenitor cells（EPCs） incubated with lipopolysaccharide（LPS） in vitro.MethodsTotal mononuclear cells（MNCs） were isolated from human peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation，and then the cells were plated on fibronectin-coated culture dishes.After 7days culture，attached cells were isolated and assessed with a laser scanning confocal microscope.EPCs were cultivated with standard EGM-2MW fluid（control group）or plus LPS（100ng/ml）（LPS group）or first incubated with LPS for 24hours and then added simvastatin of different concentrations （0.1μmol/L，1.0μmol/L and 10.0μmol/L）.The proliferation，adhesion and migration of EPCs were detected with MTT assay，modified Boyden chamber assay after 48hours respectively.And the influences of LPS and simvastatin on EPCs′proliferation，adhesion and migration were evaluated.ResultsIncubated with LPS，the proliferation of EPCs were declined significantly （P=0.009），the adhesion and migration of EPCs were also descended，but there was no significance（P=0.279，P=0.056）.With the addition of simvastatin，the proliferation，adhesion and migration of EPCs were all improved.There was hardly any improvment in the proliferation，adhesion and migration of EPCs when added of 0.1μmol/L simvastatin （P=0.687，P=0.501，P=0.683，respectively），EPCs′proliferation was improved significantly when incubated with simvastatin of 1.0μmol/L compared with LPS group（P=0.017），while the adhesion and migration were also improved but there was no significance（P=0.064，P=0.069respectively）.When incubated with simvastatin at the concentration of 10.0μmol/L the proliferation 、adhesion and migration of EPCs were all improved significantly（P=0.00，P=0.002，P=0.00respectively）compared with LPS group，and the adhesion and migration of EPCs were ameliorated significantly even compared with the EPCs cultivated with standard EGM-2MW fluid（P=0.039，P=0.000respectivly）.ConclusionLPS could cut down the proliferation of EPCs sharply，while the adhesion and migration were declined when incubated with EPCs.Simvastatin could improve the declined proliferation，adhesion and migration of EPCs which incubated with LPS first.

statins；endothelial progenitor cells；proliferation；migration；adhesion

R962

A

0258-4646（2011）02-0153-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0953.014

山東省“醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才”項目，山東省"1020工程"杰出學(xué)科帶頭人項目

邢金燕（1971-），女，副主任醫(yī)師，碩士.現(xiàn)在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院工作.

陳玉國，E-mail：chen919085@126.com

2010-10-22