血管內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達

趙恒伍，張錦程，李長有

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

血管內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達

趙恒伍，張錦程，李長有

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

目的探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對大鼠成骨細胞Ihh和p38MAPK的調(diào)節(jié)作用。方法 取胎鼠顱蓋骨分離培養(yǎng)成骨細胞，采用實時PCR檢測成骨細胞中Ihh及其受體Ptch1和p38MAPK的表達，檢測成骨細胞在不同濃度（0，2，20ng/ml）及不同時間（0，12，24h）的VEGF作用下Ihh和p38MAPK的表達情況。結(jié)果 成骨細胞表達Ihh及其受體Ptch1，同時表達p38MAPK。隨著VEGF濃度的增加，Ihh和p38MAPK的表達量均明顯增加；隨著VEGF作用時間的增加，Ihh和p38MAPK的表達量與對照組相比有明顯的增長趨勢。結(jié)論Ihh與其受體Ptch1在成骨細胞中共表達，Ihh以自分泌方式調(diào)節(jié)成骨細胞功能；VEGF上調(diào)成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達，并且VEGF可能通過調(diào)節(jié)p38MAPK的表達而影響Ihh的表達，可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh通路。

成骨細胞；大鼠；Ihh；血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血源性因子具有調(diào)節(jié)成骨細胞的功能。Hedgehog（Hh）蛋白家族包括3個成員：Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh） 和 Dersert Hedgehog（Dhh）。其中，Shh和Ihh作為重要的信號分子，在肢體發(fā)育過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ihh影響成骨細胞的發(fā)育［1］。p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路在成骨細胞增殖、分化中有重要意義［2］。本研究對VEGF是否可以調(diào)節(jié)成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：新生SD大鼠胎鼠，清潔級，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品和試劑：鼠重組VEGF蛋白（美國Pepro－Tech公司），α-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），I型膠原酶（美國Sigma公司），堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物工程研究所），茜素紅（中國醫(yī)科大學解剖教研室惠贈），Trizol、實時PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞培養(yǎng)：出生24h內(nèi)的大鼠，切下顱蓋骨，用剪刀將骨組織剪碎，0.5%Ⅰ型膠原酶5ml 37℃預消化20min，棄消化液，0.5%Ⅱ型膠原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，將骨片再次0.5%Ⅱ型膠原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，如此反復4次，將移取的消化液1000r/min離心10min，棄上清，加入培養(yǎng)液適量；混勻消化的細胞，以1.2×104/cm2接種于 25cm2培養(yǎng)瓶，置 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組：第4代成骨細胞達80%融合時，用含1%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基同步化后隨機分為：（1）正常對照組：只加1%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)；（2）VEGF 組：不同濃度（0，2，20ng/ml）及不同時間（0，12，24h）的 VEGF 培養(yǎng)。

1.2.3 實時PCR檢測IhhmRNA、Ptch1mRNA和p38MAPKmRNA的表達：Trizol提取總細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Ihh上游引物為5′-TGCCTCCGT CCTCTGCT-3′，下游引物為 5′-CACTACCTGGTCAA GTCTCAAA-3′；Ptch1上游引物為 5′-TCCTGATTGC GTCTGTTG-3′，下游引物為 5′-AGCCCTGTGGTTCT TGTC-3′；p38MAPK 上游引物為 5′-AGACCGTTTCA GTCCATCA-3′，下游引物為 5′-TCACATTCTCGTGC TTCAT-3′；內(nèi)參照 GAPDH，上游引物為 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。PCR 反應條件為 95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，45個循環(huán)。反應結(jié)束后，采用PCR儀（Gene 6000）軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 成骨細胞培養(yǎng)鑒定

成骨細胞在生長過程中表現(xiàn)出均一的短梭形或三角形，培養(yǎng)一段時間后細胞呈鋪路石樣改變，經(jīng)ALP染色胞質(zhì)呈黑紫色（圖1A，B）。含β硝酸甘油的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，可見鈣結(jié)節(jié)形成，經(jīng)茜素紅染色呈磚紅色結(jié)節(jié)（圖1C）。

2.2 成骨細胞中Ihh、Ptch1和p38MAPKmRNA的表達

PCR結(jié)果顯示，成骨細胞中Ihh及其受體Ptch1mRNA清晰表達，p38MAPKmRNA也清晰表達（圖2）。

2.3 VEGF調(diào)節(jié)成骨細胞中Ihh和p38MAPKmRNA的表達

在不同濃度（0，2，20ng/ml）VEGF 作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表達量均隨VEGF濃度的增加而增多，在20ng/ml VEGF作用下Ihh和p38MAPKmRNA的表達量分別約為無VEGF作用時的2.6倍（圖3A）和4.7倍（圖3B）；在同一劑量（20ng/ml）VEGF的作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表達量隨作用時間的延長而增多，在24h時Ihh和p38MAPKmRNA的表達量分別約為0h的2.8倍（圖4A）和 2.9倍（圖 4B）；無 VEGF作用時，Ihh和 p38MAPKmRNA的表達量隨時間延長均無明顯變化（圖4）。

3 討論

Ihh是一種分泌型蛋白，屬于Hedgehog信號家族，是果蠅節(jié)段性極性基因Hedgehog在脊椎動物體內(nèi)的同源物，主要表達于哺乳動物肥大軟骨細胞，與胚胎發(fā)育過程中骨骼的形成密切相關(guān)。Ptch1是Ihh信號通路受體細胞上的受體蛋白及下游目標基因，為一類12通道的跨膜蛋白，當Ihh蛋白與Ptch1結(jié)合后，誘導一系列下游信號分子的釋放，發(fā)揮其調(diào)控作用［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞中Ihh及其受體Ptch1同時表達。近年研究發(fā)現(xiàn)Ihh參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的軟骨內(nèi)成骨過程，其主要作用是影響軟骨細胞的終末分化，調(diào)節(jié)成骨細胞分化［4］。體外實驗證實，Ihh可促進成骨細胞分化。干預Ihh信號（Ihh缺如、抑制Ihh受體Ptch1）發(fā)現(xiàn)，鼠的骨領和初級骨小梁都未形成［5，6］。這些都說明了Ihh與其受體Ptch1結(jié)合調(diào)節(jié)成骨細胞功能。本研究證實Ihh及其受體Ptch1可在成骨細胞合成，通過自分泌方式調(diào)節(jié)成骨細胞功能。

MAPK屬絲氨酸蘇氨酸激酶，是一類分布于胞質(zhì)中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶。MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑是細胞外信號引起細胞核內(nèi)反應的通道之一，可參與細胞的形成、運動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程［7］。p38MAPK途徑是MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的通道之一，是成骨細胞增殖分化調(diào)節(jié)的重要信號通路之一［8］。本研究也證實了p38MAPK在成骨細胞是有表達的。

本研究還證實，VEGF促進成骨細胞中Ihh的表達，同時也可促進p38MAPK的表達。VEGF作用下，Ihh和p38MAPK的表達量與VEGF存在劑量依賴性和時間依賴性；隨著VEGF劑量加大、VEGF作用時間的延長，Ihh和p38MAPK的表達量增加。Kim等［9］在成骨樣細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF對p38MAPK有調(diào)節(jié)作用，這與我們研究的結(jié)果一致。但關(guān)于VEGF是否具有調(diào)節(jié)Ihh作用的文獻報道很少。Li等［10］發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞中Ihh的表達通過p38MAPK途徑，p38MAPK的表達增加可促進Ihh的表達增加。由此推斷，成骨細胞中VEGF可能通過促進p38MAPK的表達促進Ihh的表達。本研究證實，VEGF可促進Ihh的表達，VEGF作用下p38MAPK的表達與Ihh的表達有相關(guān)性。通過本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可調(diào)節(jié)p38MAPK和Ihh，提示可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh調(diào)節(jié)通路。

［1］Kesper DA，Didt-Koziel L，Vortkamp A.Gli2activator function in preosteoblasts is sufficient to mediate Ihh-dependent ssteoblast differentiation，whereas the repressor function of Gli2is dispensable for endochondral ossification［J］.Dev Dyn，2010，239（6）：1818-1826.

［2］Parreno J，Hart DA.Molecular and mechano-biology of collagen gel contraction mediated by human MG-63cells：involvement of specific intracellular signaling pathways and the cytoskeleton ［J］.Biochem Cell Biol，2009，87（6）：895-904.

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［4］Burdan F，Szumixo J，Korobowicz A，et al.Morphology and physiology of the epiphyseal growth plate ［J］.Folia Histochem Cytobiol，2009，47（1）：5-16.

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（編輯陳 姜，英文編輯王又冬）

Effect of Vascular Endothelial Growth Factor on the Expressions ofIhhandp38MARKin Osteoblasts

ZHAO Heng-wu，ZHANG Jin-cheng，LI Chang-you
（Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of vascular endothelial growth factor （VEGF）on the expressions of Indian hedgehog（Ihh）and p38mitogen-activated protein kinase （MAPK）in osteoblasts.MethodsThe osteoblasts from the calvarial of neonatal rats were cultured and treated with different concentrations （0，2，and 20ng/ml）of VEGF for various durations （0，12，and 24hours）.The expressions levels ofIhhand its receptorPtch1andp38MAPKin the osteoblasts were determined with real-time polymerase chain reaction.ResultsIhh，Ptch1，andp38MAPKexpression were observed in the osteoblasts.With the increase of the concentration of VEGF，the expressions levels ofIhhandp38MAPKsignificantly increased.Compared with control group，the expresions ofIhhandp38MAPKtended to increase with the prolongation of the duration of VEGF treatemnt.ConclusionIhhandPtch1were coexpressed in the osteoblasts.Ihhregulates the osteoblasts in an autocrine manner.VEGF might upregulates the expressions ofIhhby regulatingp38MAPKexpression.VEGF-p38MAPK-Ihh pathway might exist in the osteoblasts.

osteoblast；rat；indian hedgehog；vascular endothelial growth factor

R593.22

A

0258-4646（2011）02-0113-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.004

遼寧省自然科學基金資助項目（20092119）

趙恒伍（1985-），男，碩士研究生.

李長有，E-mail：cyli@mail.cmu.edu.cn

2010-11-23