缺氧誘導(dǎo)因子1α在宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷的胎鼠腦組織中的表達(dá)

奚琦，劉學(xué)敏，杜鵑

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

缺氧誘導(dǎo)因子1α在宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷的胎鼠腦組織中的表達(dá)

奚琦，劉學(xué)敏，杜鵑

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

目的探討宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷后不同復(fù)氧時(shí)間胎鼠腦組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）蛋白的表達(dá)規(guī)律。方法孕19d Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組和8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組4只。實(shí)驗(yàn)組建立宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型后，分別于子宮恢復(fù)血供后0、0.5、2、4、8、12、24及48h取胎鼠腦組織；對(duì)照組只暴露雙側(cè)子宮15min后，取胎鼠腦組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組缺氧誘導(dǎo)因子1α蛋白表達(dá)在術(shù)后8h明顯升高，12h達(dá)到高峰，24h后明顯下降。結(jié)論HIF-1α在宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷的胎鼠腦組織中的表達(dá)隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

缺氧誘導(dǎo)因子1α；缺氧缺血性腦損傷；胎鼠；腦組織

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是圍產(chǎn)期缺氧導(dǎo)致的腦細(xì)胞損傷，是造成兒童智力障礙及殘疾的最常見原因。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)極度依賴有氧氧化提供能量，故神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)低氧最敏感。新生兒HIE可發(fā)生在產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)及產(chǎn)后3個(gè)時(shí)期，因此將宮內(nèi)缺氧作為HIE的重要原因之一。

缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia-inducible factor 1alpha，HIF-1α）是缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使機(jī)體和組織產(chǎn)生對(duì)缺氧的適應(yīng)反應(yīng)，是近年來(lái)較受重視的腦保護(hù)因子之一。目前多數(shù)有關(guān)缺氧缺血性腦損傷治療的研究也是通過(guò)提高HIF-1α的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物模型，探討宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷后隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，胎鼠腦組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)規(guī)律，為治療宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷的時(shí)限研究提供有力的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供的健康SPF級(jí)成年雌性Wistar大鼠［合格證號(hào)：SYXK（遼 2003-0019）］36只，體質(zhì)量 250～280g，均為處女鼠，選擇9只SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠（合格證號(hào)同前），體質(zhì)量300～350g，與雌鼠分批分次以1∶1合籠過(guò)夜，第2日晨取出雄鼠，于雌鼠行陰道涂片，以顯微鏡下見到精子為交配成功。按照交配成功的先后順序分為1個(gè)對(duì)照組和8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組各4只，其中實(shí)驗(yàn)組分別為復(fù)氧 0、0.5、2、4、8、12、24、48h組。以合籠第2日記為妊娠0d，此后孕鼠分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器：UltraSensitiveTMS-P試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），HIF-1α小鼠單克隆抗體（Santa Cruz公司，德國(guó)）。恒溫培養(yǎng)箱（廣州永程實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，DNP-9162型），圖像采集系統(tǒng)Nikon ECLIPSS E800（日本）、顯微鏡Olympus CX41（日本），ImagePro Plus圖像分析軟件（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：參照杜鵑等［1］方法制備缺血缺氧胎鼠模型。于妊娠19d實(shí)施手術(shù)。步驟：（1）術(shù)前測(cè)量體質(zhì)量；（2）給予10%水合氯醛腹腔注射，劑量為3.5×10-3ml/g；（3）孕鼠取仰臥位固定四肢，備皮后術(shù)野消毒，鋪無(wú)菌巾，取腹部縱行切口，長(zhǎng)約5cm，依次切開腹壁各層進(jìn)入腹腔，探查并暴露雙側(cè)子宮，用微小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)子宮的子宮動(dòng)靜脈和卵巢動(dòng)靜脈15min，而后恢復(fù)血供，將子宮還納入腹腔，用0號(hào)絲線縫合腹壁各層。

1.2.2 胎鼠腦組織的收集：實(shí)驗(yàn)組的8個(gè)組，分別于還納子宮后 0、0.5、2、4、8、12、24及 48h 后取出胎鼠，麻醉，開腹等步驟同前。取出胎鼠后（每只孕鼠隨機(jī)取1只胎鼠），以斷頭法處死胎鼠，開顱取胎鼠大腦組織；對(duì)照組不予缺血處理，直接開腹取胎鼠腦組織，于4%多聚甲醛固定48h，經(jīng)脫水透明后石蠟包埋切片，片厚約3μm，備用。

1.2.3 HE染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化后，蘇木素染色15min，自來(lái)水沖洗3min，洗去多余的液體，1%鹽酸酒精分化，鏡下觀察分化程度，自來(lái)水沖洗返藍(lán)30min，放入95%乙醇中1min，0.5%伊紅染色3min。脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色。1.2.4 HIF-1α檢測(cè)：采用S-P免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。將制備的切片脫蠟，梯度乙醇水化，PBS液洗滌3min×3次（簡(jiǎn)稱洗滌，下同），0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）抗原修復(fù)后，0.1%胰蛋白酶再抗原修復(fù)15min，洗滌，0.1%TritonX-1001滴細(xì)胞膜打孔，洗滌，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，洗滌，正常山羊血清封閉10min，勿洗，加小鼠抗大鼠HIF-1α抗體（1∶100），4℃孵育過(guò)夜。次日晨充分洗滌后，加生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG孵育10min，充分洗滌，加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶10min，充分洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，中性樹脂封片。鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。應(yīng)用ImagePro Plus圖像分析軟件分析染色結(jié)果。光鏡下同一批次染色切片按左右皮層和海馬分別取3個(gè)不重復(fù)的視野，放大400倍，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞染色平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色病理觀察

實(shí)驗(yàn)組可見不同程度的細(xì)胞體腫脹，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，見于大腦皮層及海馬區(qū)，可見動(dòng)物模型建立成功。實(shí)驗(yàn)組復(fù)氧48h組細(xì)胞損傷程度較復(fù)氧12h組為重，細(xì)胞核固縮明顯。對(duì)照組大腦皮層及海馬排列有序，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)較少，見圖1。

2.2 HIF-1α免疫組化染色結(jié)果

HIF-1α蛋白表達(dá)主要分布于大腦皮層，海馬等區(qū)。實(shí)驗(yàn)組復(fù)氧8h后HIF-1α蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，12h達(dá)到高峰，24h開始明顯下降，見圖2；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組 0h、0.5h、2h、4h、8h、12h、24h及48h蛋白表達(dá)量分別為0.2902±0.02230，0.2994±0.04176，0.2960±0.03455，0.3060±0.04053，0.3086±0.03960，0.3276±0.00631，0.3638±0.02168，0.2856±0.00814，0.2808±0.00415；8h 及 12h 組的HIF-1α蛋白平均光密度與對(duì)照組比較，其表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24h及48h組的HIF-1α的蛋白平均光密度與12h組比較，表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

缺氧缺血性腦損傷已成為當(dāng)今產(chǎn)科和新生兒科十分關(guān)注的一種臨床疾病，無(wú)論是產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)還是產(chǎn)后的缺氧缺血性腦損傷都為家庭乃至社會(huì)帶來(lái)巨大的精神及經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于缺氧缺血性腦病的研究非常重視。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩種亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α是調(diào)節(jié)亞基，又稱活性亞基，HIF-1β是結(jié)構(gòu)亞基。HIF-1α是缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使機(jī)體和組織對(duì)外界產(chǎn)生適應(yīng)反應(yīng)，常氧條件下，HIF-1α在泛素-蛋白溶解酶體通路作用下被降解［2］，而低氧條件下，此通路被抑制，使HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)中積聚［3］，并與HIF-1β轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，但是隨著細(xì)胞氧量的恢復(fù)，HIF-1α再次移出細(xì)胞核而被降解。近年來(lái)，HIF-1α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用被不斷認(rèn)識(shí)［4］，Sheldon 等［5］的研究結(jié)果顯示：神經(jīng)元HIF-1α缺陷小鼠在腦組織缺氧缺血后的腦損傷較正常小鼠嚴(yán)重，提示HIF-1α具有腦保護(hù)作用。目前很多研究試圖通過(guò)提高HIF-1α的表達(dá)來(lái)提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)缺氧的耐受性，以達(dá)到缺血缺氧腦損傷下的腦保護(hù)作用［6］。

HIF-1α在缺氧缺血腦損傷中的作用機(jī)制仍未完全闡明，目前的研究主要集中于以下幾個(gè)方面：（1）改善腦缺血后能量代謝障礙［7］：低氧時(shí)HIF-1α可通過(guò)誘導(dǎo)丙酮酸脫氫酶激酶1的表達(dá)，使丙酮酸脫氫酶活性抑制，進(jìn)而阻斷了線粒體三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致線粒體氧耗量下降，并使得細(xì)胞內(nèi)氧張力增高，從而改善了腦缺血后的能量供應(yīng)，細(xì)胞死亡下降，腦損傷得以減輕［8］；（2）腦缺血后 HIF-1α 可以通過(guò)激活靶基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)新生血管生成，改善腦血流動(dòng)力學(xué)，使腦缺血得以迅速恢復(fù)［9］。此外，研究發(fā)現(xiàn)VEGF除了能促進(jìn)血管形成，還可能通過(guò)作用于VEGF受體，使其磷酸化并激活A(yù)Kt，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)功能［10］；（3）HIF-1α 能促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）的蛋白表達(dá)，EPO是HIF-1α重要的靶基因之一，低氧時(shí)誘導(dǎo)HIF-1α積聚，使EPO表達(dá)增加，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用［11］。

李麗華等［12，13］對(duì)于在體新生鼠神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧的研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧組新生鼠腦組織中的HIF-1α在缺血缺氧后4h表達(dá)明顯增加，8h達(dá)到高峰，24h以后逐漸降低。Stroka等［14］通過(guò)免疫組化法發(fā)現(xiàn)在體的小鼠腦組織在缺氧5h后，HIF-1α表達(dá)達(dá)到高峰，12h后降到基線水平。我們通過(guò)對(duì)缺血后不同復(fù)氧時(shí)間胎鼠腦組織中HIF-1α蛋白表達(dá)的研究結(jié)果顯示，腦組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量在復(fù)氧8h后開始明顯升高，12h達(dá)到高峰，24h后下降至正常水平。因此不論是在新生鼠、成鼠還是在胎鼠缺氧后HIF-1α蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但是達(dá)到峰值的時(shí)間不同，胎鼠達(dá)到峰值的時(shí)間最晚，提示胎鼠對(duì)缺氧缺血的調(diào)節(jié)適應(yīng)較新生鼠及成年鼠緩慢，胎兒期對(duì)缺氧缺血的耐受力不同于新生鼠及成年鼠。

綜上，宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷后，胎鼠腦組織中的HIF-1α蛋白在一定時(shí)間內(nèi)明顯增高，復(fù)氧8～12h達(dá)到高峰，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在復(fù)氧24h以后HIF-1α蛋白會(huì)逐漸回到基線水平，即HIF-1α對(duì)于胎鼠腦組織在缺氧缺血后的保護(hù)作用亦呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，因此如果在缺氧缺血后復(fù)氧的12h內(nèi)給予相應(yīng)的處理，抑制HIF-1α的降解，即可達(dá)到持續(xù)保護(hù)腦組織的作用，這將為日后胎兒宮內(nèi)缺氧缺血性腦病的防治帶來(lái)新的思路。

［1］杜鵑，尚濤，魏軼兵，等.子宮胎盤缺血對(duì)胎鼠體重及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39（4）：221-223.

［2］Semanza GL.Oxygen regulated transcription factors and their role in pulmonary disease［J］.Respir Res，2000，1（3）：159-162.

［3］Jaakkola P，Mole DR，Tian YM，et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation［J］.Science，2001，292（5516）：468-472.

［4］Kietzmann T，Knabe W，Schmidt-Kastner R.Hypoxia and hypoxia-inducible factor modulated gene expression in brain：involvement in neuroprotection and cell death ［J］.Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci，2001，251（4）：170-178.

［5］Sheldon RA，Osredkar D，Lee CL，et al.HIF-1alpha-deficient mice have increased brain injury after neonatal hypoxia-ischemia［J］.Dev Neurosci，2009，31（5）：452-458.

［6］Kasiganesan H，Sridharan V，Wright G.Prolyl hydroxylase inhibitor treatment confers whole-animal hypoxia tolerance［J］.Acta Physiol，2007，190（2）：163-169.

［7］Jones NM，Bergeron M.Hypoxia preconditioning induces changes in HIF-1target genes in neonatal rat brain ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2001，21（9）：1105-1114.

［8］Papandreou I，Caims RA，F(xiàn)ontana L，et al.HIF-1mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption［J］.Cell Metab，2006，3（3）：187-197.

［9］Matsuda T，Abe T，Wu JL，et al.Hypoxia-inducible factor-1alpha DNA induced angiogenesis in a rat cerebral ischemia model［J］.Neurol Res，2005，27（5）：503-508.

［10］Digicaylioglu M，Garden G，Timberlake S，et al.Acute neuroprotective synergy of erythropoietin and insulin-like growth factor 1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（26）：9855-9860.

［11］Gu GJ，Li YP，Peng ZY，et al.Mechanism of ischemic tolerance induced by hyperbaric oxygen preconditioning involves up-regulation of hypoxia-inducible factor-1{alpha}and erythropoietin in rats［J］.J Appl Physiol，2008，104（4）：1185-1191.

［12］李麗華，屈藝，毛萌，等.缺氧誘導(dǎo)因子1α在新生鼠缺氧缺血性腦損傷的表達(dá)及意義［J］.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2007，3（3）：126-128.

［13］李麗華，屈藝，毛萌，等.新生鼠缺氧缺血性腦損傷缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)與神經(jīng)元凋亡［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2007，21（12）：1326-1329.

［14］Stroka DM，Burkhardt T，Desbaillets I，et al.HIF-1is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia［J］.FASEB J，2001，15（13）：2445-2453.

（編輯武玉欣，英文編輯鄭華川）

The Expression of Hypoxia Inducible Factor 1Alpha in Fetal Rat Brain Tissue Injured by Intrauterine Hypoxia-ischemia

XI Qi，LIU Xue-min，DU Juan
（Department of Obsterics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression pattern of hypoxia inducible factor 1alpha（HIF-1α）in fetal rats′brain tissue injured by intrauterine hypoxia-ischemia.MethodsFetal rats were obtained from 36pregnant Wistar rats at the gestational 19days.The 36pregnant rats were randomly divided into 1control group and 8experimental groups.The pregnant rats of experimental groups were modeled into intrauterine hypoxia-ischemic brain injury，and then brain tissue of fetal rats were obtained at 0h，0.5h，2h，4h，8h，12h，24h and 48h after hypoxia，respectively.The pregnant rats in control group were not modeled and brain tissues of fetal rats were obtained directly.HIF-1α was examined by S-P immunohistochemistry.ResultsThe HIF-1α expression was gradually increased until 8h，reached maximal level after 12h and recovered to basic level by 24h.ConclusionThe expression of HIF-1α in fetal rats′brain tissue undergoes gradual increase and decrease after intrauterine hypoxia-ischemic injury.

hypoxia-inducible factor 1alpha；hypoxic-ischemic brain injured；fetal rat；brain tissue

R361

A

0258-4646（2011）01-0020-04

遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（2008T208）

奚琦（1984-），女，碩士研究生.

杜鵑，E-mail：duj@sj-hospital.org

2010-08-30