海洋低溫蛋白酶MP對肉仔雞生長發(fā)育的影響

莊志偉 郝建華 孫 謐 (山東六和集團 山東青島6606山東省青島黃海水產(chǎn)研究所酶與酶工程實驗室 山東青島66000)

海洋低溫蛋白酶MP對肉仔雞生長發(fā)育的影響

莊志偉1郝建華2孫 謐2(1山東六和集團 山東青島2660612山東省青島黃海水產(chǎn)研究所酶與酶工程實驗室 山東青島266000)

海洋低溫蛋白酶 對肉仔雞生長發(fā)育的影響

隨著生活水平的提高，特別是自1999年比利時二惡英事件和英國瘋牛病事件以來，人們越發(fā)關注由于抗生素濫用、亂用而引起的人畜健康問題，對畜產(chǎn)品安全性的呼聲越來越高，環(huán)保意識也逐步加強。積極開發(fā)新的飼料資源，提高飼料的轉(zhuǎn)化效率，降低飼料成本，促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，已成為畜牧界亟待解決的問題。飼料添加劑多種多樣，飼用酶制劑具有高度特異性和催化效率高、安全無毒害等優(yōu)點，添加蛋白酶能補充動物體內(nèi)源酶的不足，消除飼料中的抗營養(yǎng)因子，可顯著提高飼料的利用率，擴大可利用飼料資源范圍，降低養(yǎng)殖成本，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。酶制劑在飼料工業(yè)中的有效應用，使得飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)安全、高效、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展成為可能。

海洋低溫蛋白酶MP來自海洋細菌YS-80-122，經(jīng)對該蛋白酶分離純化，SDS-PAGE顯示該蛋白酶分子量大約為46KD。其最適作用溫度為30℃，最適pH為10.4，屬于低溫堿性蛋白酶。本文就海洋低溫蛋白酶MP對肉仔雞生產(chǎn)性能、免疫力的影響進行探討，為該酶的生產(chǎn)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海洋低溫蛋白酶MP由中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所提供。試驗用飼料及雞只由山東六和集團提供。

1.2 儀器設備與試劑

96孔V型微量血凝板、微型振蕩器、塑料離心管、50μL移液器、DS-671電子秤、奧立龍酸度計、恒溫箱。稀釋液為氯化鈉（GB1266-77）177g，磷酸二氫鉀（GB1274-77）13.6g，氫氧化鈉（GB629-77）3.0g，蒸餾水1000mL，高壓滅菌，4℃保存，使用時作20倍稀釋。

1.3 試驗日糧及營養(yǎng)水平

見表1。

1.4 試驗雞免疫程序

見表2。

1.5 試驗設計與方法

1.5.1 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞生產(chǎn)性能的影響

試驗雞采用1d ROSS308雛雞720只，公母混合雛，按飼養(yǎng)試驗要求均分為4個處理，公母各半，每個處理設3個重復，每個重復60只。4個處理組添加不同劑量的海洋低溫蛋白酶MP，見表3。自由采食、飲水飼養(yǎng)至35d。記錄日耗料、日增重、料肉比、平均體重和成活率。

1.5.2 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞體重影響

試驗雞采用1d ROSS308雛雞640只，進行集中育雛，預試7天，按飼養(yǎng)試驗要求隨機均分為對照組、試驗組，每組320只，設4個重復，每個重復80只，稱個體重各組間無差異（P＞0.05）。對照組飼喂基礎日糧，試驗組則在基礎日糧上添加500×10-6海洋低溫蛋白酶MP，自由采食、飲水飼養(yǎng)至42日齡，試驗期為35d。分別在2、4、6周末8∶00稱取各組雞30只體重并記錄。1.5.3海洋低溫蛋白酶MP對肉雞NDHI效價的影響

表1日糧配方與營養(yǎng)水平

表2 肉仔雞免疫程序

表3日糧設計方案

1.5.2 飼養(yǎng)至42d對試驗雞只各組取30只，用1mL一次性注射器抽出翼靜脈約0.5mL血入塑料離心管，待凝固析出血清后以1000r/min離心5min做ND HI常規(guī)試驗。

1.5.4 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞免疫器官的影響

1.5.2 飼養(yǎng)至42d試驗結(jié)束后將各組試驗雞只稱重后處死，剖檢，取出全部的脾臟、胸腺及法氏囊，用濾紙吸取表面的水分與血液后稱重，計算免疫器官指數(shù)。NDHI檢測同1.5.2。

免疫器官指數(shù)（g/g）=免疫器官重量/試驗雞只重量

1.5.5 雞腸道乳酸桿菌數(shù)量的測定

1.5.5.1 采樣及樣品稀釋

在21、35、42d分別從各處理重復中隨機抽取公母雞各2只稱重后經(jīng)口腔放血將雞處死，5%新潔爾滅消毒液浸泡全身5min，無菌剖開腹腔，將回盲結(jié)合處上和盲腸中部各5cm分別接扎，無菌取腸內(nèi)容物少許，將樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品25g加入盛有225mL無菌水的三角瓶里，在微型振蕩器上充分振搖，使樣品均勻分散，吸取5mL懸液即為10-1的樣品稀釋液，另取滅菌小試管若干，每支加入稀釋液4.5mL，取10-1的稀釋液0.5mL加入第二管10-2，以此類推做遞減稀釋，終稀釋度為10-11。

1.5.5.2 乳酸桿菌

選擇10-3～10-5的稀釋度，取100μL滴于MRS培養(yǎng)基平皿，用涂布棒涂布均勻，每個稀釋度做3個平行樣。將培養(yǎng)皿置于37℃生化厭氧箱中培養(yǎng)36h后進行菌落計數(shù)。

按下面公式計算每克內(nèi)容物中乳酸桿菌的數(shù)量。每克腸內(nèi)容物乳桿菌=3滴菌落數(shù)之和/3×滴數(shù)×稀釋倍數(shù)，計算出每克內(nèi)容物乳酸菌，計算出n log10的均值，進行統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS8.0統(tǒng)計軟件ANOVA ONE-WAY過程進行單因素的方差分析，LSD式多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞生產(chǎn)性能的影響

從表4可以看出，日糧中加入中高劑量海洋低溫蛋白酶MP明顯提高肉仔雞生產(chǎn)性能。

2.2 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞體重的影響

從表5可以看出，試驗組2周時差異不顯著（P＞0.05），4周時則提高3.85%,差異顯著（P＜0.05），6周時則提高 3.63%，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞NDHI效價的影響

從表6可以看出，試驗組與對照組ND HI抗體效價無差異（P＞0.05）。

2.4 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞只均耗料量、料肉比的影響

從表7可以看出，頭1周、第2周以及3～6周只均耗料試驗組與對照組間均無差異（P＞0.05）；成活率也差異不顯著（P＞0.05）；而料肉比提高2.65%，差異顯著（P＜0.05）。

2.5 海洋低溫蛋白酶MP對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

從表8可看出，試驗組比對照組脾臟指數(shù)21d提高1.88%，差異顯著（P＞0.05）；35d則為2.2%，差異顯著（P＞0.05）；42d則為1.91%，差異顯著（P＞0.05）。而胸腺指數(shù)21d提高5.5%，差異極顯著（P＜0.01）；35d則 2.51%，差異顯著 （P＞0.05）；42d則7.06%，差異極顯著（P＜0.01）。法氏囊指數(shù)兩者間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 海洋低溫蛋白酶MP對35d肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

表5 各組試驗雞只均體重

表7 各組試驗雞只均耗料量和飼料增重比

表8 肉仔雞免疫器官指數(shù)

表9 肉仔雞腸道中乳酸桿菌的數(shù)量

2.6 海洋低溫蛋白酶MP對腸道乳酸桿菌數(shù)量的影響

從表9可以看出，試驗組與對照組在21d乳酸桿菌的數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）；35d則差異顯著（P＜0.05）；42d則差異不顯著（P＞0.05）；只有處理2與其差異顯著（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

通過本試驗，可以看出，海洋低溫蛋白酶MP能提高肉仔雞的體重3.53%，飼料轉(zhuǎn)化率2.66%。機體免疫力與抵抗力方面，脾臟指數(shù)提高2%，胸腺指數(shù)提高4.8%，法氏囊指數(shù)變化不大，具有良好的推廣應用價值。

試驗組與對照組新城疫HI抗體水平無差異而言，與測定的法氏囊指數(shù)兩者間無差異相統(tǒng)一，因為法氏囊主要參與機體的體液免疫，這與免疫學是一致的。對于不同酶源而言，對不同的原料底物、動物品種及不同生理階段，其潛在的營養(yǎng)價值不同，因此，應進一步研究不同畜禽飼料中添加酶制劑的最佳種類和添加量，確定酶制劑的營養(yǎng)當量，建立體外酶活性和實際添加效果間的模型，從而充分地應用酶制劑的潛力，達到降低生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟效益及節(jié)約飼料資源的目的。

當今世上是發(fā)展低碳經(jīng)濟和加強環(huán)保工作，減輕畜牧生產(chǎn)對環(huán)境污染的現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)是以大規(guī)模集約化生產(chǎn)為基本特征的，對環(huán)境的污染日趨嚴重，如氮、磷造成的水體富營養(yǎng)化問題，中國的養(yǎng)殖污染在環(huán)保問題上占有很大的比重。在飼料中添加酶制劑，如蛋白酶和植酸酶等，可以降低養(yǎng)殖中氮、磷和其他元素的排泄量，有利于環(huán)境保護。

蛋白酶可以改善飼料利用率，又提高畜禽生產(chǎn)性能。飼用酶制劑可以在動物的消化道內(nèi)，將飼料中的大分子物質(zhì)水解為易吸收的小分子物質(zhì)，降低營養(yǎng)物質(zhì)在糞便中的排出量，即對內(nèi)源酶起輔助補充作用。在幼齡動物消化酶發(fā)育不完善，年老動物消化酶分泌能力降低以及受到應激或疾病感染后的動物引起消化酶分泌紊亂等情況下，外源消化酶可補充內(nèi)源酶的不足，增強動物對飼料養(yǎng)分的消化吸收能力，從而提畜禽產(chǎn)的生產(chǎn)力和飼料轉(zhuǎn)化效率。Bedford和Pack的研究表明，含有淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶的復合酶對玉米-豆粕型日糧營養(yǎng)價值有一定作用，可提高其中玉米的可利用能3%～5%。腸道中的乳酸桿菌的數(shù)量在35d時有所增加，而42d則差異不顯著，該酶能降低雞腸道內(nèi)提高乳酸桿菌的數(shù)量，而相應抑制大腸桿菌的數(shù)量，35日齡雞的腸道桿菌數(shù)量明顯高于對照組，說明海洋低溫蛋白酶能夠有效調(diào)節(jié)雞腸道內(nèi)大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，使之達到平衡。酶制劑的應用已經(jīng)引起養(yǎng)殖業(yè)和工業(yè)企業(yè)的高度重視，尤其現(xiàn)在的低碳環(huán)保經(jīng)濟，可以作為環(huán)保型飼料添加劑。

S831.4

A

1008-3847(2011)06-0002-04

國家“863”計劃項目(2007AA091602)資助

莊志偉（1968-），男，博士研究生，主要從事畜禽養(yǎng)殖和海洋產(chǎn)物資源與酶工程研究。Email：zzw19680@163.com

* 通訊作者：孫 謐（1962-），研究員。Email∶sumi@ysfri.ac.cn，Tel∶(0532)85833961

董澤敏