LC/MS技術(shù)在寡核苷酸類藥物生物樣品定量分析和代謝物鑒定中的應(yīng)用

鄧 泮,鐘大放,陳笑艷

(中國科學(xué)院上海藥物研究所,上海 201203)

LC/MS技術(shù)在寡核苷酸類藥物生物樣品定量分析和代謝物鑒定中的應(yīng)用

鄧 泮,鐘大放,陳笑艷

(中國科學(xué)院上海藥物研究所,上海 201203)

寡核苷酸是藥物發(fā)展的新領(lǐng)域,這類藥物是人工合成的DNA或RNA片段,一般由15～50個核苷酸組成,其藥動學(xué)研究的經(jīng)典方法是酶聯(lián)免疫法,但由于該方法的建立耗時、耗資,因此成為新藥研發(fā)的瓶頸。液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用技術(shù)在寡核苷酸類藥物生物分析中面臨的主要問題有:待測物離子化效率低、基質(zhì)效應(yīng)嚴重、色譜分離條件與質(zhì)譜不易兼容,樣品處理回收率低,但該方法建立快速且選擇性強,并能夠同時進行代謝產(chǎn)物研究,因此,這項技術(shù)盡管存在一些缺點但依然備受關(guān)注。本文綜述了過去15年中LC/MS技術(shù)在寡核苷酸類藥物生物樣品定量分析和代謝物鑒定中的發(fā)展和應(yīng)用。

寡核苷酸藥物;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;生物樣品

在過去的10年中,寡核苷酸類藥物已逐漸成為藥物發(fā)展的新領(lǐng)域,這類化合物被證實可用于多種疾病的治療,例如癌癥、病毒細菌感染、自身免疫、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及代謝疾病[1-2]。該類藥物是人工合成的DNA或 RNA片段,一般由15～50個核苷酸組成[3],其作用靶點為產(chǎn)生疾病蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)作用機理的不同可分為多類,其中,應(yīng)用最廣泛、開發(fā)前景最好的主要有兩類:反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,AS-OGNs)和短干擾 RNA(si-RNAs)。AS-OGNs是 DNA或 RNA單鏈片段,其核苷酸序列可與靶mRNA或靶DNA雜交,抑制或封閉該基因的轉(zhuǎn)錄和表達,或誘導(dǎo)RNaseH識別并切割 mRNA使其喪失功能,從而發(fā)揮治療作用[2]。si-RNAs是一種雙鏈RNA,通過RNA干擾通路影響基因表達[4],與AS-OGNs相比,這類化合物的藥用研究起步較晚,目前均處于研發(fā)階段尚未有上市藥物。已被美國FDA批準上市的AS-OGNs類藥物有治療年齡相關(guān)性黃斑變性的Macugen(美國 Eyetech公司,24 mer-OGN)和用于治療巨細胞病毒引起視網(wǎng)膜炎的Fomivirsen(美國ISIS公司,21 mer-OGN),此外,尚有20余種 AS-OGNs類藥物正處于臨床研究階段[5]。天然寡核苷酸進入體內(nèi)后易被降解,因此只有通過化學(xué)修飾提高穩(wěn)定性才能達到藥用目的。已上市和處于開發(fā)階段的寡核苷酸類藥物主要是硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotides,PS-OGNs)和2’-烷氧基修飾的混合骨架寡核苷酸(mixedbackbone oligonucleotides,MBOs)[6],典型核苷酸基團示于圖1。在 PS-OGNs的磷酸二酯鍵中,1個非橋鍵的氧原子被硫原子所取代,經(jīng)硫代修飾后的寡核苷酸可有效抵抗核酸酶的降解,提高藥物的血漿蛋白結(jié)合率及其在組織中的分布,同時也會延緩藥物的腎臟排泄[7]。MBOs是在核糖的2’位末端進行修飾,其中以2’-O-甲基和2’-O-甲氧乙基修飾最具代表性。MBOs具有更強的靶RNA親和性和更好的代謝穩(wěn)定性[8]。其他磷酸骨架和核糖修飾的寡核苷酸包括嗎啉代的寡核苷酸、肽核酸和鎖核酸等,目前這些寡核苷酸的應(yīng)用有限[9]。

圖1 結(jié)構(gòu)改造后的典型核苷酸基團Fig.1 Representative modified nucleic acid building blocks

在臨床前及臨床研究階段,定量分析生物樣品中的寡核苷酸,以及鑒定代謝產(chǎn)物在其藥代動力學(xué)(PK)、藥動學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)和毒代動力學(xué)(TK)評價中是至關(guān)重要的,這不僅為寡核苷酸藥物提供PK、TK及代謝途徑等重要信息,還對這類藥物的結(jié)構(gòu)改造起到指導(dǎo)作用,達到改善藥物穩(wěn)定性和降低清除率的目的。目前,寡核苷酸的生物樣品定量分析方法包括基于雜交技術(shù)的酶聯(lián)免疫法(ELISA)、放射性同位素法、毛細管凝膠電泳法(CGE-UV/熒光)和高效液相色譜法(HPLC-UV/熒光),這些方法在應(yīng)用中都有其各自的特點及局限性[10]。其中,ELISA法以其高靈敏度和高通量的顯著優(yōu)勢在寡核苷酸藥物的 PK/TK研究中獲得了最為廣泛的應(yīng)用[11-12],但它無法區(qū)分全長的寡核苷酸和核酸水解的代謝產(chǎn)物,易產(chǎn)生交叉雜交的現(xiàn)象,導(dǎo)致原藥濃度被高估[10]。此外,為獲得專屬性試劑,ELISA方法的開發(fā)周期長(6～12個月)、成本高,通常成為寡核苷酸藥物臨床前和臨床研究中的瓶頸。

液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用技術(shù)將具有高分離能力的液相色譜法與高靈敏度和選擇性的質(zhì)譜法結(jié)合起來,雖然該技術(shù)已在小分子化合物和多肽的生物樣品分析中得到廣泛應(yīng)用,但由于寡核苷酸類藥物分子的多種特性(如酸性強極性、離子化效率低、易產(chǎn)生大量的金屬加合離子),以及由這些性質(zhì)導(dǎo)致的生物樣品回收率不穩(wěn)定和LC/MS分析中存在的嚴重基質(zhì)效應(yīng)、靈敏度低等問題,都成為LC/MS生物樣品分析方法開發(fā)中需要攻克的難關(guān)[5,13]。本工作將對LC/MS技術(shù)在寡核苷酸類藥物生物樣品定量分析和代謝物鑒定中的應(yīng)用進行綜述。

1 寡核苷酸類藥物生物分析中的LC/MS方法開發(fā)

1.1 質(zhì)譜檢測

1.1.1 離子化 目前,寡核苷酸類藥物在臨床上多采用靜脈或皮下給藥方式,給藥后藥物在體內(nèi)迅速分布,然后進入消除相,消除相的血藥濃度很低且維持時間較長,因此,為了準確描述消除相藥時曲線,定量分析方法需要較高的靈敏度。ELISA法的靈敏度在眾多定量分析方法中最高,可達1μg/L以下,能夠檢測到給藥后170 h的血藥濃度[12]。寡核苷酸屬于酸性強極性化合物,結(jié)構(gòu)中的每個磷酸二酯鍵上都帶有1個酸性質(zhì)子(p Ka～1)[14],通常這類化合物在 ESI源負離子模式下的響應(yīng)較好,此外,由于這類化合物含有至少15個核苷酸基團,每個磷酸二酯鍵上的酸性質(zhì)子在ESI軟電離過程中均可能發(fā)生去質(zhì)子反應(yīng),因此,在 ESI(-)檢測條件下形成多重電荷形式的離子。根據(jù)這些特點,利用常規(guī)質(zhì)荷比范圍的質(zhì)譜儀即可實現(xiàn)這類大分子離子的測定(＞6 000 u),但這種多重質(zhì)譜峰的存在使質(zhì)譜信號被分散到了多個前體離子上,并且由于寡核苷酸的磷酸骨架帶有多個陰離子,很容易結(jié)合Na+、K+等金屬陽離子,進一步分散了質(zhì)譜信號[14-15]。因此,對這類化合物質(zhì)譜條件優(yōu)化的目的,一方面是改善待測物的多電荷分布,針對豐度較高的前體離子優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù);另一方面是減少待測物在質(zhì)譜分析時加合離子的形成。影響寡核苷酸離子化效率的因素主要包括溶液p H值,陽離子濃度和有機溶劑組成[5]。寡核苷酸是酸性化合物,使用質(zhì)譜兼容的有機堿(如三乙胺(TEA))有助于提高質(zhì)譜響應(yīng),但由于寡核苷酸能夠與TEA通過離子鍵和作用形成“假中性分子”,造成寡核苷酸的電荷被屏蔽,使其在ESI源氣化過程中難以通過庫倫爆炸從小液滴中釋放出來成為氣態(tài)離子,從而產(chǎn)生信號抑制的現(xiàn)象[5]。Apffel等[16]于1997年發(fā)現(xiàn),采用六氟異丙醇(HFIP)/TEA的緩沖液體系能夠極大地提高寡核苷酸類化合物的質(zhì)譜響應(yīng),自此之后,HFIP/TEA成為LC/MS分析寡核苷酸的常用緩沖液體系[17-20]。其原理是 HFIP(p Ka～9,bp=57℃)在p H 7.0的條件下呈分子狀態(tài)自由揮發(fā),在離子化和去溶劑過程中,液滴表面的HFIP揮發(fā)殆盡,p H值升高至10,在這樣的條件下,寡核苷酸-TEA離子對能夠順利解離,促使寡核苷酸氣態(tài)離子的生成[16]。此外,有機堿TEA還能夠有效抑制金屬加合離子的形成[21]。Apffel等[16]對比了 4種不同溶劑體系下,50 pmol寡聚胸腺嘧啶核苷酸dT20溶液的質(zhì)譜響應(yīng) ,包括 400 mmol/L HFIP/TEA(p H 7),水(p H 7),100 mmol/L醋酸三乙胺(TEAA)水溶液和25 mmol/L TEA水溶液(p H 10),示于圖2。結(jié)果顯示,使用400 mmol/L HFIP/TEA溶液體系時,dT20的質(zhì)譜響應(yīng)是使用25 mmol/L TEA水溶液的2倍,使用 TEAA時質(zhì)譜響應(yīng)極低,而使用水作為溶劑時,檢測到大量的加合離子。

由于寡核苷酸色譜分離中通常使用水相比例較高的流動相體系,因此柱后灌流有機溶劑(乙腈、甲醇或異丙醇)是改善這類化合物離子化效率、提高質(zhì)譜響應(yīng)的有效途徑[5]。此外,柱后灌流0.1 mol/L咪唑乙腈溶液也能顯著改善寡核苷酸的質(zhì)譜響應(yīng)[22],但其機理有待進一步研究。

1.1.2 質(zhì)量分析器 在寡核苷酸的LC/MS分析中,常見的質(zhì)量分析器是三重四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜和飛行時間質(zhì)譜。三重四極桿質(zhì)譜具有離子傳輸效率高、動態(tài)范圍寬和靈敏度高的特點,在定量分析中具有顯著的優(yōu)勢[18-19,23-25]。寡核苷酸在三重四極桿質(zhì)譜中經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)解離主要產(chǎn)生嘧啶和磷酸的碎片離子,對序列分析沒有幫助。一種24個核苷酸的硫代寡核苷酸(PF-ODN,5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’)在 API 3000、API 4000、API 5000和Agilent 6460四種型號的三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀形成的碎片離子均比較單一,主要是m/z95磷酸離子和m/z125胸腺嘧啶碎片離子,示于圖3[18-19]。另一種18個核苷酸的2’-烷氧基取代的硫代寡核苷酸在API 4000質(zhì)譜儀上得到的主要碎片離子質(zhì)荷比同樣是m/z95和125[17],且產(chǎn)生這兩種碎片離子所需的碰撞能量均較高。

圖2 寡聚胸腺嘧啶核苷酸dT20溶液(50 pmol)在不同溶劑中ESI總離子流響應(yīng)對比[16]Fig.2 Comparison of ESI total ion currents of 50 pmol dT20 in different solvents[16]

圖3 硫代寡核苷酸PF-ODN在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析時的碎片離子質(zhì)譜圖[19]Fig.3 Mass fragments of PS-ODN on triple quandrople mass spectrometry[19]

離子阱質(zhì)譜能夠產(chǎn)生與寡核苷酸序列相關(guān)的w和a-B系列的診斷性離子[26],以硫代寡核苷酸為例,其在離子阱質(zhì)譜上的裂解方式示于圖4。其中,w系列離子的末端是5’-磷酸,用來判斷3’→5’方向的核苷酸序列;a-B系列離子末端是3’-呋喃,用來判斷 5’→3’方向的核苷酸序列[20,27-28],這些離子不僅可以用來對寡核苷酸進行定量,還可以用于鑒定其代謝產(chǎn)物[20]。Dai等[20]使用離子阱質(zhì)譜得到一種18個核苷酸的硫代寡核苷酸(G3139,5’-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3’)的w和a-B系列碎片離子,并將其作為產(chǎn)物離子用于定量分析。Simple Oligonucleotide Sequencer(SOS)軟件能夠通過w和a-B的質(zhì)譜碎片離子快速分析核酸序列[29],目前已有關(guān)于此軟件在代謝物鑒定中應(yīng)用的報道[27]。L TQ Orbitrap質(zhì)譜能夠通過高分辨數(shù)據(jù)確認代謝物核苷酸的組成,區(qū)分質(zhì)量相差不到1 u的代謝物[30],但這類離子阱質(zhì)譜檢測器的靈敏度和動態(tài)范圍均不及四極桿質(zhì)譜。飛行時間質(zhì)譜主要用于寡核苷酸的定性研究,目前未見其在定量分析中應(yīng)用的報道。

不論使用何種檢測器,TEA已經(jīng)成為寡核苷酸質(zhì)譜分析中必不可少的添加劑,但 TEA屬于難揮發(fā)性堿,易吸附在質(zhì)譜檢測器上,造成儀器污染并導(dǎo)致質(zhì)譜檢測靈敏度顯著下降,這成為質(zhì)譜儀在寡核苷酸類藥物生物分析應(yīng)用中的限制因素。為保證質(zhì)譜儀的正常運作,使用 TEA對寡核苷酸進行質(zhì)譜分析時,需要及時清洗質(zhì)譜檢測器,或在不影響檢測靈敏度的前提下適當提高氣簾氣的流量,盡量減少進入質(zhì)譜儀的 TEA濃度[24]。

1.2 與質(zhì)譜兼容的反相離子對色譜法

圖4 硫代寡核苷酸在離子阱質(zhì)譜分析時的質(zhì)譜斷裂方式Fig.4 Mass fragment pattern of phosphorothioate oligonucleotide on ion-trap mass spectrometry

寡核苷酸為酸性強極性化合物,在普通反相色譜柱上幾乎無保留,為增加這類化合物的色譜保留,可以在流動相中加入適當?shù)膲A性離子對試劑與寡核苷酸離子結(jié)合形成離子對,此離子對在流動相中不易解離,而在反相C18鍵合相中保留,進而在固定相和流動相間進行分配,最終實現(xiàn)色譜分離[14,31]。這種反相離子對色譜法(IPRP-HPLC)已成為寡核苷酸色譜分析的首選技術(shù)。早期的IP-RP-HPLC-UV分析方法使用醋酸三乙胺作為流動相中的離子對試劑,帶正電的三乙胺與寡核苷酸陰離子形成離子對,顯著改善了寡核苷酸在反相色譜柱上的保留和峰形[32]。流動相體系中醋酸三乙胺的濃度通常為50～100 mmol/L(p H 7.0)。在醋酸三乙胺的緩沖液體系中,醋酸的p Ka 4.75,沸點較高為118℃,在p H 7.0的條件下幾乎完全處于解離狀態(tài),因此在質(zhì)譜離子源的去溶劑過程中無法揮發(fā),使寡核苷酸難以從小液滴中釋放出來成為氣態(tài)離子,產(chǎn)生明顯的信號抑制現(xiàn)象[16]。與醋酸三乙胺性質(zhì)類似的重碳酸三乙胺(TEAB)也被用于IP-RP-HPLC法分離寡核苷酸,但與醋酸三乙胺存在同樣的質(zhì)譜信號抑制現(xiàn)象[33]。這兩種離子對試劑雖然已經(jīng)普遍應(yīng)用于寡核苷酸的 HPLCUV分析中[32,34-35],但由于其與質(zhì)譜的兼容性不佳,在寡核苷酸的LC/MS定量分析中均未能獲得廣泛的使用。此外,醋酸三乙胺對寡核苷酸混合物的分離能力也不及 TEA/HFIP流動相體系[36]。

TEA/HFIP成為LC/MS法分析寡核苷酸時的首選離子對試劑緩沖液體系。在色譜分離中,TEA發(fā)揮著離子對試劑的作用,其濃度決定寡核苷酸的色譜保留行為[31,37]。Gilar等[32]研究了不同的 TEA緩沖液體系對堿基數(shù)為10～30的寡核苷酸混合物的分離能力,示于圖5。結(jié)果顯示,使用含有16.3 mmol/L TEA/400 mmol/L HFIP(p H 7.9)的緩沖液體系分離效果最好,其次為 4.1 mmol/L TEA/100 mmol/L HFIP(p H 8.2)體系,而在含有 0.1 mol/L TEAA(p H 7.0)的流動相中存在分離度不佳的寡核苷酸共流現(xiàn)象。在質(zhì)譜檢測中,TEA從兩方面提高寡核苷酸的質(zhì)譜響應(yīng):1)作為有機堿提高酸性寡核苷酸的去質(zhì)子效率;2)抑制寡核苷酸金屬加合離子的產(chǎn)生。若流動相中離子對試劑濃度低,可能導(dǎo)致寡核苷酸保留效果不佳、分離度差或不能有效去除質(zhì)譜檢測中金屬加合離子的干擾;若濃度過高,可能直接抑制質(zhì)譜響應(yīng),因此在優(yōu)化流動相中水相的離子對試劑和有機溶劑時,需要綜合考慮色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)兩方面因素,并最終在二者之間達成平衡。

圖5 使用不同離子對試劑緩沖液的核苷酸數(shù)10～30的寡核苷酸混合物分離效果對比[32]Fig.5 Separation of 10-30 mer oligonucleotides using different ion-pairing buffers[32]

在核酸水解酶的作用下,寡核苷酸能夠在體內(nèi)生成核苷酸片段斷裂的代謝產(chǎn)物[38]。雖然質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式能夠選擇性監(jiān)測原形和代謝產(chǎn)物,但由于同類寡核苷酸的碎片離子極為相似,在 SRM分析時可能發(fā)生交叉干擾[18-19],因此有必要提高色譜分離能力,避免原形和代謝物之間的干擾。目前,測定生物樣品中寡核苷酸的液相色譜方法均采用梯度洗脫模式,與等度洗脫相比,這種色譜條件對寡核苷酸的分離度高,并且有助于改善色譜峰形、減少拖尾。但寡核苷酸對流動相中初始有機溶劑/水相比例很敏感,有機相/水相比例過小或過大會造成待測寡核苷酸不出峰或死時間出峰的極端結(jié)果。因此,在優(yōu)化流動相梯度條件時需要謹慎選擇初始有機溶劑/水相比例[32]。此外,使用緩慢的梯度變化條件也有助于原形和各種核苷酸片段水解的代謝產(chǎn)物實現(xiàn)基線分離[36]。

1.3 生物樣品預(yù)處理

在復(fù)雜的生物基質(zhì)中,存在大量鹽類、磷脂、蛋白質(zhì)和其他有機或者無機成分,對于小分子化合物而言,這些成分會對LC/MS分析產(chǎn)生影響并導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)[39],但對于寡核苷酸這類生物大分子來說,基質(zhì)中鹽類的存在將導(dǎo)致大量金屬加合離子的生成,而蛋白質(zhì)則是影響其色譜行為并產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的主要因素。由于寡核苷酸經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后,蛋白結(jié)合率顯著提高[40],因此在樣品預(yù)處理階段,去除生物樣品中的鹽和蛋白質(zhì)對于LC/MS分析的順利進行是至關(guān)重要的。沉淀蛋白法(PPT),固相萃取(SPE)和液液提取(LL E)均被應(yīng)用于寡核苷酸的生物樣品預(yù)處理。PPT法樣品提取回收率低,并且由于難以充分去除蛋白質(zhì),在樣品分析時會產(chǎn)生顯著的基質(zhì)效應(yīng)[10];SPE法中應(yīng)用比較廣泛的是Oasis HLB柱(美國 Waters公司產(chǎn)品)[18-20,24],與色譜分離原理相同,在SPE小柱活化和淋洗的過程中均需要使用 TEA緩沖液才能達到保留寡核苷酸和洗脫干擾基質(zhì)的目的,此外還有陰離子交換SPE柱 Poros HQ/M(美國 Perseptive Biosystems公司產(chǎn)品)[15,41]。但是,SPE法處理后的樣品在LC/MS分析時也同樣存在基質(zhì)效應(yīng)的影響[20,24]。苯酚-二氯甲烷/氯仿-異丙醇的 LL E法能夠有效去除基質(zhì)中的蛋白[25],SPE法能夠富集待測物并進一步去除基質(zhì),這兩種方法的結(jié)合使用不僅提取回收率較高,而且獲得的樣品在分析時還能充分避免基質(zhì)的影響[18-19,42]。

寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特異性吸附,對容器進行烷基化處理并采用含有 TEA的溶劑溶解樣品,能夠避免非特異性吸附[18]。在生物定量樣品分析中,解決非特異性吸附的問題對保證結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性也至關(guān)重要。

2 LC/MS方法應(yīng)用于寡核苷酸藥物的定量及定性研究

LC/MS法應(yīng)用于寡核苷酸的生物樣品定量分析列于表1。定量分析方法采用LLE、SPE或二者的組合進行樣品預(yù)處理,液相色譜分離時多使用含有 TEA/HFIP的離子對色譜進行梯度洗脫,質(zhì)譜檢測均使用ESI源負離子的MRM掃描模式,并且將多組MRM信號加合,有助于提高質(zhì)譜定量分析的靈敏度[19,23]。PF-ODN是輝瑞公司開發(fā)的用于治療肺癌的含有24個核苷酸的PS-OGN類藥物。Zhang等[18]建立了LCMS/MS法用于定量分析大鼠血漿中的原形化合物 PF-ODN,使用 Hypersil GOLD C18色譜柱,1.7 mmol/L TEA/100 mmol/L HFIP(p H 7.5)的流動相緩沖液體系梯度洗脫,定量下限為5.0μg/L。根據(jù)實際經(jīng)驗,Zhang等[18]提出了建立寡核苷酸類藥物的LC/MS定量方法的一般流程,示于圖6。本文作者[19]在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件,使用 Phenomenex GeminiC18色譜柱,流動相中加入2.85 mmol/L TEA/100 mmol/L HFIP(p H 7.8),在梯度洗脫條件下,使原形和4種核苷酸片段水解的代謝產(chǎn)物 5’N-1/3’N-1、5’N-2 和5’N-3基本實現(xiàn)色譜分離,避免了多組分在質(zhì)譜檢測中的相互干擾,實現(xiàn)了大鼠血漿中PF-ODN和4種代謝物的同時定量,定量下限為4.0 μg/L,示于圖7。該方法被應(yīng)用于大鼠靜脈給予1.0 mg/kg PF-ODN后,血漿中原形及代謝物的定量,初步描述了 PF-ODN在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程。

圖6 寡核苷酸類藥物的LC/MS生物分析方法建立流程Fig.6 Flowchart describes the recommended strategy for developing bioanalytical method of therapeutic oligonucleotides using LC/MS

圖7 大鼠血漿中PF-ODN及其代謝物的典型MRM色譜圖Fig.7 Representative MRM chromatograms of PF-ODNand its metabolites in rat plasma

與小分子藥物相同,成功的寡核苷酸藥物需要有良好的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性。確定寡核苷酸藥物的代謝位點能夠指導(dǎo)結(jié)構(gòu)改造,了解代謝途徑,有助于預(yù)測其毒性及藥效。在體內(nèi),寡核苷酸可在3’-核酸外切酶和5’-核酸外切酶的作用下發(fā)生磷酸二酯鍵水解,分別從核酸鏈的3’和5’端丟失核苷酸片段。通常按照丟失的核苷酸數(shù)目將這些代謝產(chǎn)物標記為 3’N-1,5’N-1,3’N-2,5’N-2……等[19,27-28,43-44]。寡核苷酸代謝產(chǎn)物鑒定中常用的質(zhì)譜儀是離子阱質(zhì)譜,Wei等[27]使用離子阱質(zhì)譜儀鑒定了 GTI-2040(5’-GGCTAAATCGCTCCACCAAG-3’) 在 不同生物樣品中的代謝產(chǎn)物。在受試者血漿中共檢測到5種 GTI-2040的3’端核苷酸依次水解的代謝產(chǎn)物,在大鼠肝腎勻漿液和人肝微粒體中也檢測到3’端核苷酸水解的代謝產(chǎn)物。由于GTI-2040的3’和5’端均為鳥嘌呤核苷酸,根據(jù)準分子離子信息無法判斷N-1(M1)這種代謝產(chǎn)物究竟是3’N-1還是 5’N-1,然而 ,離子阱質(zhì)譜的優(yōu)勢在于能夠獲得w和a-B系列碎片離子,結(jié)合SOS軟件可以確定相應(yīng)的核苷酸序列。對比3’N-1和5’N-1對照品的二級質(zhì)譜碎片離子信息發(fā)現(xiàn),3’N-1和5’N-1對照品的w和a-B系列碎片離子存在明顯區(qū)別,示于圖8。圖8a中,m/z674.9的w2-1離子和m/z870.4的a5-B5-2離子分別對應(yīng)化合物 3’N-1的 3’AA和5’GGCTA核苷酸序列;而圖 8b中,m/z691.1的w2-1離子和m/z862.6的a5-B5-2離子分別對應(yīng)化合物5’N-1的 3’GA 和 5’GCTAA 核苷酸序列。根據(jù)這一特點,結(jié)合M1的二級質(zhì)譜信息最終確認其為3’N-1核苷酸水解代謝產(chǎn)物。Zou等[30]使用L TQ Orbitrap高分辨質(zhì)譜鑒定了 HBV263(siRNA)的體外代謝物,采集的LC/MS數(shù)據(jù)通過ProMass去卷積軟件處理后,能夠自動計算出代謝物的相對分子質(zhì)量,并推測其可能的核苷酸序列,此外,高分辨的質(zhì)譜數(shù)據(jù)能夠準確區(qū)分質(zhì)量數(shù)相差0.982 7 u的兩個代謝物。

圖8 m/z1 004[M-6H]6-的前體離子通過碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的碎片離子及其歸屬[27]Fig.8 Fragment ions assignments following collision-induced dissociation of the precursor ions atm/z1 004[M-6H]6-[27]

3 總結(jié)和展望

隨著LC/MS技術(shù)的發(fā)展,無論是在寡核苷酸類藥物的生物樣品定量分析方面,還是在代謝產(chǎn)物定性方面,LC/MS都具有顯著的優(yōu)勢和鮮明的特點。因此,盡管這項分析技術(shù)目前還存在諸如進樣器殘留[19]、靈敏度不及 ELISA方法、樣品預(yù)處理步驟繁瑣等缺點,但它依然備受關(guān)注。LC/MS領(lǐng)域不斷有新技術(shù)、新儀器被開發(fā)和使用,如專門針對消除殘留設(shè)計的Nanospace HTS自動進樣器(日本島津公司產(chǎn)品);整合了新技術(shù)并使檢測靈敏度顯著提高的新型質(zhì)譜儀,如Q-Trap 5500四極-線性離子阱雜交質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品)、Xevo TQ三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國沃特世公司產(chǎn)品)、TSQ Vantage三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品)以及Agilent 6490三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司產(chǎn)品);適用于酸性強極性化合物的多種復(fù)合型SPE填料,以及用于寡核苷酸SPE快速提取的Clarity OTX試劑(美國菲羅門公司產(chǎn)品);根據(jù)親水性相互作用開發(fā)的,適用于強極性化合物的多種 HILIC色譜柱[45]和專門針對寡核苷酸色譜分析開發(fā)的玻璃包覆棒狀色譜柱(日本資生堂公司產(chǎn)品)的使用,可以提高LC/MS分析時流動相中有機相/水相的比例,有助于提高待測物離子化效率。這些技術(shù)在寡核苷酸類藥物分析中的應(yīng)用有待實踐檢驗,相信LC/MS法在寡核苷酸生物樣品分析領(lǐng)域的應(yīng)用會不斷深入。

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Quantitative Analysis and Metabolite Identification of Therapeutic Oligonucleotides in Biological Samples Using LC/MS

DENG Pan,ZHONG Da-fang,CHEN Xiao-yan
(S hanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai201203,China)

Therapeutic oligonucleotides have become as a new drug class.They are synthetic DNA or RNA that typically between 15 and 50 nucleotide units long.In the pharmacokinetic studies of therapeutic oligonucleotides,the classical method was enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).However,the development of ELISA method was time-consuming and expensive,and has become the bottleneck in the new drug research and development.The technical issues associated with liquid chromatography-mass spectrometry(LC/MS)method in the bioanalysis of oligonucleotides included:limited ionization efficiency,severe matrix effect,incompatibility of chromatographic condition and MS detection,and low sample preparation recovery.However,the development of an LC/MS method was fast,and this method was selective.This review summarized the development and applications of LC/MS method for the quantitation of therapeutic oligonucleotides and characterization of their metabolites in biological samples described in the literatures over the past 15 years.

therapeutic oligonucleotides;liquid chromatography-mass spectrometry(LC/MS);biological samples

陳笑艷(1971～),女,黑龍江人,研究員,從事藥物代謝與藥代動力學(xué)研究。E-mail:xychen@mail.shcnc.ac.cn

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0013-11

2010-12-04;

2011-01-14

鄧 泮(1984～),女,陜西人,博士研究生,從事藥物代謝與藥代動力學(xué)研究。E-mail:panda4177@126.com