PPV感染Marc-145細(xì)胞后對(duì)其分泌IL-13轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響

劉 石，哈斯通拉嘎，王瑞寧，郭東輝，胡清林，魏戰(zhàn)勇

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;3.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南鄭州 450002)

PPV感染Marc-145細(xì)胞后對(duì)其分泌IL-13轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響

劉 石1，2，哈斯通拉嘎3，王瑞寧2，郭東輝2，胡清林2，魏戰(zhàn)勇2

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;3.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南鄭州 450002)

運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，測(cè)定和分析豬細(xì)小病毒 (PPV)感染Marc-145細(xì)胞后引起的病毒DNA含量的變化和IL-13的分泌水平。結(jié)果IL-13的表達(dá)量在1，3和24 h明顯增加，48 h輕微下調(diào)。

Marc-145細(xì)胞;白細(xì)胞介素13;豬細(xì)小病毒;轉(zhuǎn)錄時(shí)相

豬細(xì)小病毒 (Porcine parvovirus，PPV)是引起妊娠母豬繁殖障礙的主要病原體之一。初產(chǎn)妊娠母豬感染后，經(jīng)胎盤侵襲胚胎或胎兒，引起母豬流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形及木乃伊化，致使母豬不孕或反復(fù)發(fā)情，同時(shí)還可引起仔豬的皮炎和腹瀉［1］。豬細(xì)小病毒在豬群中檢出率甚高，在豬群中的血清抗體陽性率達(dá)50%～80%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。炎性細(xì)胞因子特別是白細(xì)胞介素具有介導(dǎo)天然免疫、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活化、生長(zhǎng)和分化等免疫調(diào)節(jié)作用，是目前臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［3］。體內(nèi)白細(xì)胞介素的表達(dá)發(fā)生異常，與機(jī)體免疫功能低下或發(fā)生病理損傷有關(guān)［4］。對(duì)炎性細(xì)胞因子特別是白細(xì)胞介素表達(dá)量的準(zhǔn)確測(cè)定，反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)、揭示疾病的發(fā)病機(jī)理、探索感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答規(guī)律均具有重要意義。常用的檢測(cè)白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子的方法 (放射免疫法、ELISA、MTT法)不同程度上存在靈敏度不高、污染環(huán)境、費(fèi)時(shí)、操作復(fù)雜和難以準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)，對(duì)操作者和環(huán)境造成毒害的問題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其準(zhǔn)確、快速、定量的優(yōu)點(diǎn)，迅速被應(yīng)用于功能基因組、分子醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、微生物學(xué)及生物工藝學(xué)等領(lǐng)域［5］，也是測(cè)定在細(xì)胞因子的表達(dá)研究方面主要手段之一。我們利用SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，分不同時(shí)間點(diǎn)定量檢測(cè)PPV感染Marc-145后IL-13 mRNA的表達(dá)水平，以便為研究IL-13的抗細(xì)小病毒機(jī)制提供理論參考和試驗(yàn)依據(jù)，并為預(yù)防控制PPV提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

豬細(xì)小病毒7909標(biāo)準(zhǔn)毒株 (PPV-7909)購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，病毒滴度為106.1TCID50·mL－1。

1.1.2 細(xì)胞

Marc-145細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%新生犢牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO237℃培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

Protein K(Promega公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCOBR公司);Trypsin(Invitrogen);胎牛血清 (Hyclone公司);E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA);SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

Mastercycle ep realplex Real-Time PCR 儀(Eppendorf公司);臺(tái)式高速低溫離心機(jī) (德國(guó)Sigma公司);PTC-200型PCR儀 (M J Research公司);紫外凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)SIM公司);小型臺(tái)式離心機(jī) (德國(guó)Sigma公司)。

1.2 病毒感染

將Marc-145細(xì)胞用胰酶溶液分散后，培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板 (2×105個(gè)·孔－1)，培養(yǎng)細(xì)胞豐度達(dá)80%后，用PBS洗2次，將PPV接種于Marc-145，吸附60 min，期間每隔15 min輕輕晃動(dòng)1次，洗去未吸附的病毒，添加含有2%胎牛血清的DMEM維持液。

1.3 細(xì)胞的收集

將病毒感染后1，3，24和48 h的細(xì)胞分別用PBS洗2次，添加0.25%胰酶消化細(xì)胞，1 000 g離心10 min收集 Marc-145細(xì)胞，保存于 －80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA及RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

按蛋白酶K法提取病毒DNA，參照E.Z.N.A Total RNA KitⅠ說明書提取細(xì)胞總RNA，具體方法和步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行［6］，以提取的總 RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA及提取的DNA作為熒光定量PCR模板。

1.5 引物和相對(duì)定量PCR

引物的設(shè)計(jì)使用Primer Premier 5.0軟件，參照GenBank公布序列進(jìn)行?；蛎Q、參考序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為 20 μL，其中 SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 600 ng。反應(yīng)條件為95℃ 1 min;95℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束升溫至95℃ 15 s，再降至60℃ 15 s，開始從60℃遞增至95℃ 20 min，采集熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，于95℃15 s結(jié)束反應(yīng)。

表1 Real-time PCR引物及其反應(yīng)條件

1.6 數(shù)據(jù)處理

在實(shí)時(shí)定量PCR中，Ct值是反映模板中目標(biāo)基因含量的一個(gè)重要指標(biāo)，通過樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值比較，可以準(zhǔn)確計(jì)算出RNA含量。另外，將目標(biāo)基因與持家基因β-actin比較，消除由于收集細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄和加樣中操作誤差。將0 h未接種病毒的細(xì)胞因子的表達(dá)量設(shè)為1×，使用Mastercycle ep realplex Real-Time PCR軟件分析各基因相對(duì)于0 h的表達(dá)量變化水平。

2 結(jié)果和分析

2.1 病毒DNA水平測(cè)定

Marc-145單層細(xì)胞感染 PPV后，在1，3，24和48 h分別收集細(xì)胞，提取DNA，做熒光定量PCR，與β-actin進(jìn)行比較分析，并將病毒感染1 h時(shí)病毒DNA含量定義為1×，得出不同時(shí)間病毒DNA在細(xì)胞的增殖倍數(shù)，結(jié)果見圖1。

圖1 PPV在Marc-145細(xì)胞中增殖規(guī)律

由圖1可知，病毒感染后1 h就可以檢測(cè)到病毒DNA，但病毒量相對(duì)較低;隨后開始逐步上升，在感染后24 h病毒開始大量迅速增殖，48 h達(dá)到最高峰，從感染后24 h的13倍增殖到170倍左右。

2.2 細(xì)胞因子的測(cè)定

Marc-145單層細(xì)胞在感染PPV后1，3，24和48 h分別收集細(xì)胞，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，做熒光定量PCR，并與β-actin進(jìn)行比較分析，并以病毒感染0 h時(shí)mRNA含量定義為1×，得出不同時(shí)間細(xì)胞因子RNA在細(xì)胞的增殖倍數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖2 白細(xì)胞介素IL-13的轉(zhuǎn)錄時(shí)相

由圖2可知，IL-13的表達(dá)量在1，3和24 h明顯增加，48 h輕微下降低于細(xì)胞對(duì)照水平。

3 小結(jié)和討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出了一種新技術(shù)，它是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析［7］。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測(cè)的飛躍，而且所有反應(yīng)均在同一溶液中進(jìn)行，不需任何后處理過程，具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、定量結(jié)果具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)［8］。目前在不同的研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

PPV可以在ST、PK-15、Marc-145等多種細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變。本研究發(fā)現(xiàn)在PPV感染Marc-145細(xì)胞后1 h能檢測(cè)到病毒，24 h后開始大量增殖，在感染后48 h達(dá)最高峰，達(dá)到170倍左右，這可能是由于病毒大量增殖，釋放所致。

白細(xì)胞介素 (IL)主要是由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，在傳遞信息、激活和調(diào)節(jié)免疫及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)IL以來，已經(jīng)有33種IL相繼被發(fā)現(xiàn)。白細(xì)胞介素13(IL-13)是由活化的T細(xì)胞分泌的一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，在不同的細(xì)胞類型如單核細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中功能不同。它能誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)IgE合成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)某些粘附分子及抑制HIV-1病毒復(fù)制，并對(duì)某些癌細(xì)胞具有高度毒性［9－10］。具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體免疫應(yīng)答中可抑制單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子而具有顯著的抗炎能力，并能促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體的分泌［11］，在過敏性炎癥反應(yīng)過程中起重要的作用［12］。IL-13能抑制IL-12產(chǎn)生，但能誘導(dǎo)Th1類細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ 的產(chǎn)生［13］。

本試驗(yàn)研究表明，PPV感染Marc-145細(xì)胞后IL-13的表達(dá)量在1，3和24 h明顯增加，48 h輕微下降低于細(xì)胞對(duì)照水平。Briere等［14］研究表明，IL-13不能抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程，但能明顯抑制病毒蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶的產(chǎn)生，降低病毒的細(xì)胞致病性。我們推測(cè)在PPV感染 PK-15細(xì)胞后促炎細(xì)胞因子的表達(dá)先于抗炎細(xì)胞因子，在1 h時(shí)啟動(dòng)抗炎細(xì)胞因子IL-13作為自我防御機(jī)制參與細(xì)胞免疫過程，細(xì)胞中IL-13 mRNA的表達(dá)水平可作為觀察病情活動(dòng)狀態(tài)的一個(gè)免疫學(xué)指標(biāo)。

本試驗(yàn)利用熒光定量PCR測(cè)定和分析PPV感染Marc-145細(xì)胞后細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的變化，PPV感染后可引起Marc-145細(xì)胞分泌IL-13，且感染后1，3和24 h明顯增加。這為以后PPV分子致病機(jī)制，評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫效果和藥物抗病毒的藥效機(jī)制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

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S 852.4

A

0528-9017(2011)03-0710-03

文獻(xiàn)著錄格式:劉石，哈斯通拉嘎，王瑞寧，等.PPV感染Marc-145細(xì)胞后對(duì)其分泌IL-13轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(3):710－713.

2011-03-08

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目 (08210213007)

劉 石 (1984－)，男，河南鄭州人，學(xué)士，主要從事分子免疫學(xué)和分子病毒學(xué)研究工作。E-mail:hnls60@126.com。

注:胡清林系通信作者。

(責(zé)任編輯:吳益?zhèn)?