大黃牡丹湯加減對腹膜粘連大鼠t-PA、PAI變化的調(diào)節(jié)作用

董 迎，崔華雷，王曉曄，董 亮

大黃牡丹湯加減對腹膜粘連大鼠t-PA、PAI變化的調(diào)節(jié)作用

董 迎，崔華雷，王曉曄，董 亮

目的：觀察大黃牡丹湯加減對腹膜粘連大鼠血漿中t-PA、PAI變化的影響。方法：采用開腹鉗夾腸管法制作腹膜粘連大鼠模型，檢測其血漿中組織纖維蛋白溶酶原激活劑（t-PA）、纖溶酶原激活劑抑制因子（PAI）含量，觀察腹膜粘連程度。結(jié)果：大黃牡丹湯加減可以增加腹膜粘連大鼠血漿t-PA含量，降低血漿PAI含量，使腹膜粘連減輕。結(jié)論：大黃牡丹湯可以減輕大鼠腹膜粘連程度。

腹膜粘連；大黃牡丹湯；t-PA（組織纖維蛋白溶酶原激活劑）；PAI（纖溶酶原激活劑抑制因子）

腹膜粘連是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，通常認(rèn)為與創(chuàng)傷、異物、缺血、炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。在腹膜粘連的過程中，纖溶活性的降低是腹膜粘連形成的最主要原因[3]。組織纖維蛋白溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）和纖溶酶原激活劑抑制因子(plasminogen activator inhibitor，PAI)二者的平衡決定了纖溶酶原激活劑的活性。在以往的試驗(yàn)中，我們成功地制作了腹膜粘連模型，并進(jìn)行了病理觀察[4]。本實(shí)驗(yàn)通過制作腹膜粘連的動物模型后，經(jīng)大黃牡丹湯加減灌胃，觀察中藥對大鼠血漿中t-PA、PAI水平的影響，探討大黃牡丹湯對腹膜粘連的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Wistar大鼠（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK-[軍2007-004]）180只，雌雄各半,體質(zhì)量(220±10)g。

1.2 主要試劑 PAI、t-PA酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)公司。

1.3 中藥制備 大黃牡丹湯加減由天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供，制作濃度為1 g生藥/mL，中藥治療組每鼠每天灌胃1次，每次4 mL,直至大鼠處死取材。大黃牡丹湯加減的方劑組成為：大黃、乳香、沒藥各6 g,丹皮、桃仁、冬瓜子、薏米仁、山甲、皂刺各10 g，敗醬草20 g。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物模型制備 大鼠術(shù)前禁食6～8 h，以5 g/L戊巴比妥鈉，（0.1 mg/10 g）腹腔注射麻醉，沿胃小彎尋找十二指腸、小腸，用止血鉗輕擦腸管約0.5 cm，以腸壁充血為標(biāo)準(zhǔn)。共搓擦5處，間隔5 cm左右。術(shù)后12 h開始喂水，第2 d用標(biāo)準(zhǔn)顆?；旌巷暳?由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)喂養(yǎng)。

1.4.2 動物分組 隨機(jī)分為3組，每組60只。創(chuàng)傷粘連組：沿胃小彎尋找十二指腸、小腸，用止血鉗輕擦腸管約0.5 cm，以腸壁充血為標(biāo)準(zhǔn)。共搓擦5處，間隔5 cm左右。術(shù)后12 h開始喂水，第2 d用標(biāo)準(zhǔn)顆粒混合飼料(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)喂養(yǎng)。中藥治療組：在創(chuàng)傷粘連組的基礎(chǔ)上，于術(shù)后12 h給予中藥灌胃，第2 d常規(guī)喂養(yǎng)。制作腹膜粘連、中藥干預(yù)的模型。假手術(shù)組：輕輕翻動腸管后關(guān)腹，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.4.3 標(biāo)本采集 3組大鼠分別于造模后3、7、14、28 d以頸部脫臼法處死，觀察腹膜粘連情況，取粘連部位組織制作蠟塊封存，行HE染色，光鏡下觀察病理變化。取血4 mL置于含有1/10體積0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液的試管中，3 000 r離心10 min。收集血漿，-70℃保存。

1.4.4 檢測指標(biāo) 腹膜粘連情況按Nair的五級分類法[5]的基礎(chǔ)上分六級，即0級：完全無粘連；一級：內(nèi)臟之間未形成粘連索帶，但有膿性滲出；二級：內(nèi)臟與腹壁間一條粘連索帶；三級：內(nèi)臟與腹壁間二條粘連索帶；四級：多于兩條粘連索帶；五級：內(nèi)臟直接粘連到腹壁，而不管粘連帶多少。分級后按級數(shù)打分，0級為0分，一級為1分，依次類推五級為5分。

PAI、t-PA的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法。先將濃稀釋液、濃洗滌液用蒸餾水稀釋。確定標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)后開始加樣，每孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或待測標(biāo)本100 μL，每個待測標(biāo)本制作3個復(fù)孔，空白對照孔（加入100 μL 1640培養(yǎng)基）制作3個復(fù)孔。37℃孵育150 min。棄取反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿每孔，靜置3 s，甩干，反復(fù)3次后拍干。每孔加入酶標(biāo)抗體100 μL，37℃孵育60 min。棄取反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板3次后拍干。每孔加入底物液100 μL，37℃孵育15～20 min。每孔加終止液50 μL。在酶標(biāo)儀上492 nm處，以空白對照孔調(diào)零，測定各孔OD值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測樣本值。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 腹膜粘連情況利用Ridit分析行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.005表示各組間粘連分級存在差異性有統(tǒng)計學(xué)意義。各組大鼠治療后各時段血漿t-PA、PAI水平為計量資料，以(±s)表示,采用方差分析行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體結(jié)果 創(chuàng)傷粘連組：術(shù)后3d處死的大鼠可見少許清亮淡血性滲出，損傷局部有明顯的充血水腫，可見膿性分泌物。術(shù)后7d處死的大鼠腹腔內(nèi)滲出較3d處死的大鼠明顯減少，小腸與大網(wǎng)膜、肝臟、胰腺之間形成片狀粘連，可分開。術(shù)后14d處死的大鼠腹腔內(nèi)無明顯滲出，小腸與大網(wǎng)膜、肝臟、胰腺之間粘連呈索帶樣，粘連較緊密，不易分開，分開后腸管有損傷。術(shù)后28d處死的大鼠腹腔內(nèi)無滲出，小腸與大網(wǎng)膜、肝臟、胰腺之間可見纖維索帶樣粘連，粘連無法分開。

中藥治療組：術(shù)后3d處死的大鼠可見少許清亮淡血性滲出，損傷局部有明顯的充血水腫，有膿性分泌物覆蓋。術(shù)后7d處死的大鼠腹腔內(nèi)無明顯滲出，小腸與大網(wǎng)膜、肝臟、胰腺之間粘連呈片狀易分開，損傷腸管基本愈合。術(shù)后14d處死的大鼠腹腔內(nèi)無滲出，小腸與大網(wǎng)膜、肝臟、胰腺之間部分粘連呈索帶樣，粘連較緊密，可分開，分開后腸管充血明顯無損傷。術(shù)后28d處死的大鼠腹腔內(nèi)無滲出，小腸與大網(wǎng)膜、肝臟、胰腺之間可見纖維索帶樣粘連，未見內(nèi)臟直接與腹膜粘連，粘連無法分開。

假手術(shù)組：分別于術(shù)后3、7、14、28d處死，無腹膜粘連情況。

通過以上結(jié)果可以看出，術(shù)后3d各組動物腹腔內(nèi)均無粘連形成，除假手術(shù)組為0級外，其余各組均為1級，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后7d各組間粘連分級開始出現(xiàn)差異性（見表1）。

表1 各組動物腹膜粘連情況Ridit分析結(jié)果

2.2 細(xì)胞因子檢測結(jié)果

2.2.1 t-PA 創(chuàng)傷粘連組、中藥治療組兩組術(shù)后第3 d t-PA較假手術(shù)組低，以創(chuàng)傷粘連組最為明顯。術(shù)后7d，中藥治療組t-PA值升高至假手術(shù)組范圍(P<0.05)，而創(chuàng)傷粘連組t-PA值無明顯升高(P>0.05)，中藥治療組較創(chuàng)傷粘連組 t-PA值升高(P>0.05)，14～28 d，創(chuàng)傷粘連組和中藥治療組兩組數(shù)值均升高至假手術(shù)組范圍（見表2）。

表2 各組大鼠治療后各時段血漿t-PA水平（ng/mL,n=15,±s)

表2 各組大鼠治療后各時段血漿t-PA水平（ng/mL,n=15,±s)

注：與假手術(shù)相比，*P<0.05；與創(chuàng)傷粘連組相比,△P<0.05

組別假手術(shù)組創(chuàng)傷粘連組中藥治療組3 d 9.8±0.9 8.7±0.8*8.9±0.6*7 d 10.1±1.0 8.8±0.7*9.6±0.6△14 d 10.0±0.8 9.2±0.5*9.8±0.8 28 d 10.0±0.6 9.5±0.7 9.8±0.4

2.2.2 PAI 創(chuàng)傷粘連組、中藥治療組兩組術(shù)后第3 d PAI較假手術(shù)組高，以創(chuàng)傷粘連組最為明顯。術(shù)后7 d，中藥治療組PAI值降低至假手術(shù)組范圍(P<0.05)，而創(chuàng)傷粘連組PAI值無明顯降低(P>0.05)，中藥治療組較創(chuàng)傷粘連組 PAI值降低(P>0.05)，14～28 d，創(chuàng)傷粘連組和中藥治療組兩組數(shù)值均降低至假手術(shù)組范圍（見表3）。

表3 各組大鼠治療后各時段血漿PAI水平（ng/mL，n=15，±s)

表3 各組大鼠治療后各時段血漿PAI水平（ng/mL，n=15，±s)

注：與假手術(shù)相比，*P<0.05；與創(chuàng)傷粘連組相比,△P<0.05

組別假手術(shù)組創(chuàng)傷粘連組中藥治療組3 d 1.6±0.4 2.3±0.3*2.0±0.5*7 d 1.6±0.5 2.2±0.6*1.7±0.3△14 d 1.5±0.6 1.8±0.6 1.5±0.4 28 d 1.6±0.3 1.5±0.5 1.4±0.5

3 討論

腹膜粘連是術(shù)后困擾外科醫(yī)生的常見并發(fā)癥。腹膜粘連的發(fā)生機(jī)制與腹膜纖溶活性降低、腹膜纖維蛋白膠狀物形成和溶解動態(tài)平衡失調(diào)、組織纖維蛋白酶原激活劑活性降低、纖維蛋白酶原抑制劑活性增高有關(guān)[6]。腹膜粘連時機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥細(xì)胞[7]，而這些炎癥細(xì)胞又分泌t-PA和PAI。由于t-PA、PAI的不同作用，調(diào)節(jié)著血漿中的纖溶活性，t-PA／PAI比值與纖溶活性呈正比關(guān)系，t-PA／PAI比值高，纖溶活性相對亢進(jìn)，t-PA／PAI比值低，纖溶活性相對降低[8]。有研究表明，粘連是否形成，取決于術(shù)后5～7d[9]。因此，在炎癥早期降低炎癥反應(yīng)，使t-PA升高、PAI降低，是減輕粘連的關(guān)鍵?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過手術(shù)清除體內(nèi)炎癥滲出物，并配合靜脈輸液等治療，減輕造成腹膜粘連的因素，進(jìn)而預(yù)防腹膜粘連。祖國醫(yī)學(xué)則通過口服中藥達(dá)到清熱解毒、瀉下通便等作用，力求達(dá)到同樣效果。大黃牡丹湯便是典型的方劑之一，方中生大黃苦寒攻下，瀉腸中濕熱郁結(jié)，祛腸中稽留之瘀血；桃仁苦平，性善破血，與大黃配伍，破瘀瀉熱，兩藥共為君藥；牡丹辛苦微寒，涼血化瘀，為臣藥；冬瓜子甘寒，清腸利濕，排膿散結(jié)，為佐使藥。諸藥合用，既可瀉熱破瘀，又可散結(jié)消腫，使腸中濕熱血瘀之邪，迅速祛除[10]。

通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，未予中藥干預(yù)炎癥過程的大鼠腹膜粘連程度較重，Nair分級較高，t-PA升高的速度較慢；PAI下降的速度與t-PA升高的速度平行，一般要到術(shù)后14 d后才有變化。而服用中藥的大鼠腹膜粘連程度較輕，Nair分級較低，t-PA升高的速度較快，PAI下降的速度與t-PA升高的速度平行，一般到術(shù)后3～7 d即有變化。改變了粘連形成關(guān)鍵時期兩者的比例，即t-PA和PAI的比例變化，決定了機(jī)體是否存在腹膜粘連的現(xiàn)象。因此，調(diào)節(jié)t-PA和PAI的比例就可起到減少手術(shù)后腹膜粘連的發(fā)生。大黃牡丹湯加減調(diào)節(jié)了炎癥早期體內(nèi)t-PA和PAI的含量，降低機(jī)體內(nèi)粘連的形成，可確實(shí)起到減輕粘連的作用。

[1]Tarhan OR,Eroglu A,Cetin R,et al.Effects of seprafilm on perito?neal fibrinolytic system[J].ANZ J Surg,2005,75(8)：69.

[2]Polymeneas G,Theodosopoulos T,Stamatiadis A,et al.A compara?tive study of postoperative adhesion formation after laparoscopic vs open cholecystectomy[J].Surg Endosc,2001,15(1)：41.

[3]Hellebrekers BW,Trimbos-Kemper TC,Trimbos JB,et al.Use of fibrinolytic agents in the prevention of postoperative adhesion for?mation[J].Fertil Steril.2000，74(2)：203.

[4]崔華雷,王曉曄,谷繼卿,等.腹膜粘連動態(tài)過程的細(xì)胞機(jī)制研究[J].中華小兒外科雜志,2007,28(9)：490.

[5]Molinas CR Mynbaev O.Pauwel A,et al.Peritoneal mesothelial hy?poxia duting pneumoperitoneum is a cofactor adhesion formation in a laparoscopic mouse model[J].Fertil Steril,2001，76：(3)：560．

[6]曾健,李曉輝.腹膜粘連的分子機(jī)制及藥物防治[J].世界華人消化雜志,2003,11(9)：1429.

[7]徐彥,潘立群,施義,等.川芎嗪溫敏緩釋凝膠抗大鼠術(shù)后腹腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2007,39(10)：74.

[8]李光榮,溫先勇,熊文娟,等.t-PA,PAI-1檢測在腦梗死患者中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2009,22(1)：10.

[9]Wallwiener M,Brucker S,Hierlemann H,et al.Innovative barriers for peritoneal adhesion prevention：liquid or solid?A rat uterine horn model[J].Fertil Steril，2006，86(4 Suppl)：1266.

[10]胡宗德,張雅萍,賀衛(wèi),等.大黃牡丹湯對創(chuàng)傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征的治療作用[J].上海中醫(yī)藥雜志,2006,40(12)：20.

Effect of“Dahuang Mudan(大黃牡丹)Decoction’Treatment on Plasma Tissue-type-Plasminogen Activa? tor and Pasminogen Activator Inhibitor Levels in Rats with Peritoneal Adhesion

Dong Ying,Cui Hualei,Wang Xiaoye,et al.Micro-invasion Surgery,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin(300074),China

ObjectiveTo observe the effect of Dahuang Mudan(大黃牡丹)Decoction on plasma tissue-type plasminogen activator(t-PA)and plasminogen activator inhibitor(PAI)levels in rats with peritoneal adhesion.MethodsAdopting the method of forceps clip intestinal canal through laparotomy,rats models with peritoneal adhesion were made.To observe peritoneal adhesion grade,plasma t-PA and PAI levels were measured before and after Dahuang Mudanpi Decoction treatment.ResultsPlasma t-PA level was elevated while PAI level reduced after Dahuang Mudanpi Decoction treatment.ConclusionDahuang Mudanpi Decoction treatment may prevent peritoneal adhesion in rats by affecting the excretion ratio of t-PA and PAI levels.

peritoneal adhesion,Dahuang Mudan decoction,t-PA,PAI

R656.4；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0069-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.025

天津市兒童醫(yī)院微創(chuàng)外科（天津 300074）

崔華雷,E-mail：chlfjp@sina.com

（收稿：2010-04-02 修回：2010-09-16）

（責(zé)任編輯 劉洪斌 田在善）