和厚樸酚抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的研究

王葉萍 李學(xué)琴 浙江省長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 長(zhǎng)興 313100

吳志剛 程林芳 姚航平 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

和厚樸酚抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的研究

王葉萍 李學(xué)琴 浙江省長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 長(zhǎng)興 313100

吳志剛 程林芳 姚航平 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的：觀察和厚樸酚（HNK）對(duì)內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞（HRMCs）炎癥反應(yīng)的抑制作用及其分子機(jī)制研究。方法：以MTS法檢測(cè)和厚樸酚（0～160μmol/L）對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞的毒性作用，確定合適的藥物實(shí)驗(yàn)濃度。將系膜細(xì)胞與LPS（1μg/ml）及不同濃度的和厚樸酚（0～20μmol/L）共同培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞，并提取細(xì)胞蛋白。ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α、IL-18及TGF-β1的表達(dá)水平，免疫印跡Western blot法檢測(cè)細(xì)胞NF-κB p65,IKK-α/β及IKB-α磷酸化、非磷酸化蛋白表達(dá)水平，探討和厚樸酚的抗炎作用機(jī)制。結(jié)果:20μmol/L及以下的和厚樸酚濃度對(duì)系膜細(xì)胞無明顯毒性作用，但40μmol/L及以上的濃度明顯降低系膜細(xì)胞的增殖活力。LPS刺激可顯著誘導(dǎo)系膜細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-18及TGF-β1的產(chǎn)生。和厚樸酚（0～20μmol/L）劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示，和厚樸酚可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞NF-κB p65,IKK-α/β及IKB-α等信號(hào)分子蛋白磷酸化水平。結(jié)論：和厚樸酚能有效抑制LPS誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，其機(jī)制部分通過抑制細(xì)胞NF-κB p65、IKK-α/β及IKB-α等信號(hào)分子的磷酸化水平。

人腎小球系膜細(xì)胞 和厚樸酚 炎癥因子

腎小球系膜細(xì)胞在腎小球?yàn)V過率的調(diào)節(jié)中起著很重要的作用，包括吞噬免疫復(fù)合物及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。當(dāng)系膜細(xì)胞受到免疫因素或者炎癥刺激時(shí)，可產(chǎn)生大量的炎癥因子造成或加重腎損傷[1]。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）或者其他刺激因素如高血糖均可激活系膜細(xì)胞，增加炎癥因子的表達(dá)。因此，探討抑制腎臟疾病中系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的藥物治療意義重大。和厚樸酚是從木蘭科中藥中純化出來的一種活性成分，研究表明，和厚樸酚具有抗氧化，抗炎及抗血管增生等作用[2]。和厚樸酚還能強(qiáng)烈抑制細(xì)胞核因子NF-κB的轉(zhuǎn)位和磷酸化活性，而NF-κB的轉(zhuǎn)位和磷酸化激活正是炎癥及腫瘤血管再生的關(guān)鍵步驟[3]。本研究通過建立LPS刺激系膜細(xì)胞，觀察和厚樸酚對(duì)系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的抑制作用，并初步探討其抗炎作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料 LPS（美國Sigma公司）。和厚樸酚（HNK，純度98.7%，北京中國藥品生物制品檢定所）。MTS細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（美國Promega公司）。細(xì)胞因子 IL-1β、IL-18、TNF-α、TGF-β1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）。NF-κB p65、IKK-α/β、IKB-α的磷酸化及非磷酸化抗體和細(xì)胞裂解液（美國Cell Signaling Technilogy公司）。兔抗β-actin抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（美國Santa Cruz公司）。細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清（Invitrogen公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎小球系膜細(xì)胞(HRMCs)購自美國ScienCell研究所。細(xì)胞自復(fù)蘇后第3～5代用于本實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)中傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 細(xì)胞以1×104/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，用含不同濃度和厚樸酚（0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL MTS/PMS反應(yīng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀490nm測(cè)定吸光度值，以吸光值的表示細(xì)胞增殖活性的高低和藥物對(duì)細(xì)胞毒性作用的大小。

1.4 ELISA法炎癥細(xì)胞因子檢測(cè) 將細(xì)胞以3×105/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度（0～20μmol/L）的和厚樸酚預(yù)處理1h，然后加入終濃度為1μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分組見表1。收集培養(yǎng)上清液用ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α、TGF-β1的表達(dá)水平。檢測(cè)程序嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線求得各檢測(cè)樣本中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法

1.5 Western Blot法檢測(cè) NF-κB p65、IKK-α/β、IKB-α的磷酸化及非磷酸蛋白 收集各組細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液冰浴30min后，于4℃ 10 000rpm離心3min，收集離心上清液，于蛋白分析儀上用BCA法測(cè)定各樣品蛋白含量。取20μg蛋白樣品加蛋白上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10%SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，于封閉液（5%BSA）室溫封閉2h，分別加入抗NF-κB p65、抗IKK-α/β、抗IKB-α磷酸化及非磷酸抗體和抗β-actin抗體，于雜交爐中室溫滾動(dòng)反應(yīng)2h；洗膜5min×3次，加相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫反應(yīng)2h；充分洗膜后加ECL化學(xué)發(fā)光底物，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光熒光成像分析系統(tǒng)（BioRad，VersaDoc5000MP）曝光成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用one-way analysis of variance(ANOVA)方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 和厚樸酚對(duì)系膜細(xì)胞增殖活力的影響 將系膜細(xì)胞培養(yǎng)在含不同濃度的和厚樸酚（0～160μ mol/L）的培養(yǎng)液中24h后進(jìn)行MTS檢測(cè)。0～20μmol/L濃度的和厚樸酚沒有改變系膜細(xì)胞的增殖活力，對(duì)細(xì)胞無明顯的毒性作用。而40μmol/L及以上的濃度顯著影響系膜細(xì)胞的增殖活力，見圖1。因此，在本研究選擇0～20μmol/L的和厚樸酚濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 和厚樸酚對(duì)系膜細(xì)胞增殖活力的影響

2.2 對(duì)LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的抑制作用 使用ELISA法檢測(cè)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α及TGF-β1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，LPS刺激可顯著誘導(dǎo)系膜細(xì)胞IL-1β、IL-18、 TNF-α及TGF-β1的產(chǎn)生，而和厚樸酚則可呈劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的以上炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。其IC50對(duì)IL-1β約為10μmol/L,對(duì)IL-18、TNF-α、TGF-β1約為20μmol/L，見圖2。

圖2 和厚樸酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)增加的抑制作用

2.3 和厚樸酚對(duì)系膜細(xì)胞NF-κB途徑信號(hào)分子表達(dá)及磷酸化的影響 在本研究中，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS刺激顯著增加系膜細(xì)胞NF-κB p65、IKK-α/β、IKB-α的磷酸化活性。和厚樸酚處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65、IKK-α/β、IKB-α信號(hào)分子的磷酸化活性，其抑制作用呈劑量依賴性，見圖3。

圖3 和厚樸酚對(duì)系膜細(xì)胞NF-κB途徑信號(hào)分子表達(dá)及磷酸化的影響

3 討 論

系膜在腎小球的解剖結(jié)構(gòu)中占據(jù)著中心位置，并在免疫介導(dǎo)的腎小球疾病中通過積極參與局部炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。系膜細(xì)胞的作用正是對(duì)腎小球損傷的病理刺激進(jìn)行應(yīng)答[4]。近年來，從天然植物中尋找安全有效的藥物成為研究的熱點(diǎn)之一。有體內(nèi)研究表明，和厚樸酚2.5mg/kg體重灌胃可明顯減少抗Thy1抗體誘導(dǎo)的腎炎大鼠模型腎小球細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1及I型膠原的表達(dá)[5]。新近研究表明，和厚樸酚能有效抑制LPS及PMA刺激的多種細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的免疫反應(yīng)[6]。本研究MTS分析結(jié)果顯示,和厚樸酚0～20μmol/L濃度完全不影響系膜細(xì)胞的增殖活力，對(duì)細(xì)胞無毒性作用，且可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。

TNF-α在炎癥過程中往往是一個(gè)起始因素，腎臟疾病時(shí)，其他炎癥因子如IL-1β、IL-18、TGF-β1[7-9]在腎臟表達(dá)明顯增加。這些因子可進(jìn)一步刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并促進(jìn)腎臟疾病進(jìn)展[7]。本研究中，LPS處理導(dǎo)致系膜細(xì)胞上清液中以上炎癥因子表達(dá)增加,而此炎癥因子表達(dá)增加的效應(yīng)被加入的和厚樸酚顯著抑制，且其抑制作用呈劑量依賴性。同時(shí)，本研究也初步探討了和厚樸酚抑制LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)途徑。眾所周知，NF-κB通過調(diào)節(jié)編碼前炎癥細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子及生長(zhǎng)因子基因的表達(dá)體現(xiàn)其在炎癥過程中的中心地位[10]。研究結(jié)果表明，和厚樸酚可劑量依賴地抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞NF-κB p65、IKK-α/β及IKB-α的磷酸化活性，并在20μmol/L時(shí)達(dá)到最大的效應(yīng)。

本研究表明，和厚樸酚可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，其抑制炎癥因子表達(dá)的作用，至少部分是通過抑制細(xì)胞NF-κB信號(hào)途徑的NF-κB p65、IKK-α/β及IKB-α等信息分子的磷酸化活性而實(shí)現(xiàn)的。和厚樸酚對(duì)腎系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的抑制效應(yīng)，有可能在臨床炎性腎病的防治中發(fā)揮重要作用。

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Inhibitory Effects of Honokiol on Lipopolysaccharide-Induced inflammatory Cytokine Production in Human Renal Mesangial Cells

WANG Yeping,WU Zhigang,LI Xueqin,et al.Department of Clinical Laboratory,the People's Hospital of Changxing, Changxing(313100),China

Objective:To investigate the anti-inflammatory effects of honokiol and the signaling mechanisms involved in lipopolysaccharide(LPS)-induced conditions in human renal mesangial cells(HRMCs).MethodsThe safe dosage of honokiol for HRMCs was initially identified by using the[3,4-(5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt(MTS)]assay.HRMCs were pretreated with honokiol(0～20 μmol/L)and then incubated in the presence or absence of LPS (1 μg/mL)for 24 h.The expression levels of interleukin(IL)-1β, IL-18,tumor necrosis factor-(TNF-α),and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in treated HRMCs were determined by ELISA.The levels of phosphorylated and nonphosphorylated antibodies against NF-κB p65,IKK-α/β and IKB-α were detected with western blotting.ResultsHonokiol did not significantly change HRMCs viability at a concentration of＜20 μmol/L but markedly altered cell viability at concentrations of＞40 μmol/L.LPS treatment led to a marked upregulation of the levels of IL-1β,IL-18,TNF-α and TGF-β1 in HRMCs.The upregulation of these molecules was significantly abolished by honokiol in a dose-dependent manner;honokiol almost completely reversed IL-1β expression at 10 μmol/L,and IL-18,TNF-α,TGF-β1 expression at 20 μmol/L.In addition,phospho-NF-p65,phospho-IKK-α/β and phospho-IKB-α were dramatically suppressed by honokiol.ConclusionHonokiol can inhibit the LPS-induced expression of inflammatory cytokines in HRMCs,partly by suppressing the NF-κB signaling pathway.

human renal mesangial cells honokiolinflammation cytokine

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2006Y007，2008CA047）.通訊作者：姚航平，Email:yaohangping@zju.edu.cn

2010-09-13

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