超聲強化超臨界提取大黃中5種蒽醌衍生物的研究

李衛(wèi)民， 王治平， 劉 杰， 葉雪蘭， 邱志兵， 李慶國

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

大黃來源于蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖。具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功，用于實熱便秘，積滯腹痛，瀉痢不爽，濕熱黃疸等［1］。其主要成分為蒽醌衍生物，制劑多采用煎煮法提?。?］，蒽醌類成分因受熱時間過長而降解，致通腸作用明顯減弱［3］，同時也影響提取率。超臨界流體萃取(SFE)技術(shù)在很大程度上避免了傳統(tǒng)提取過程的缺陷，并且屬于環(huán)境友好的綠色提取技術(shù)［4-5］。但是，該技術(shù)也存在一些需要解決的問題，如高壓操作，對設(shè)備的要求高，萃取效率有待進一步提高等［6］。超聲能產(chǎn)生空化效應(yīng)，具粉碎、攪拌、乳化等特殊作用，使植物組織在溶劑中瞬時產(chǎn)生的空化泡的崩潰，而使組織中細(xì)胞破裂，以利于溶劑浸透到植物細(xì)胞內(nèi)部，使植物中的有效成分溶于溶劑之中［7］。目前已有相關(guān)文獻報道將超聲技術(shù)引入到SFE萃取中，并探討了超聲參數(shù)對萃取率的影響［6］。

本試驗采用自行設(shè)計改造的超聲強化超臨界流體萃取裝置，以大黃藥材中5種蒽醌衍生物成分為提取對象，比較超聲提取(U)、超臨界流體萃取(SFE)和超聲強化超臨界流體萃取(USFE)提取大黃5種蒽醌衍生物成分的提取率。為開發(fā)植物藥有效成分提取新技術(shù)和大黃及其復(fù)方制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

超臨界提取裝置(江蘇華安科研儀器有限公司，5 L)，超聲波發(fā)生器(廣州華南超聲設(shè)備有限公司，超聲強度2 000 W，頻率20 kHz)，超聲強化超臨界提取裝置(自行設(shè)計，由上述2種設(shè)備改裝而成)示意圖見圖1;CO2氣體購于廣州億祥貿(mào)易公司供應(yīng)，純度達99.5%以上;SHIMADZU LC-10AT vp plus高效液相色譜儀，SHIMADZU SPD-10A vp plus紫外檢測器，SHIMADZU CBM-10A vp plus化學(xué)工作站;Sartorius CP225D電子分析天平(德國，d=0.01 mg);鹽酸、三氯甲烷、甲醇、乙醇等為分析純，水為制備純水。對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(含量測定用，批號分別為:蘆薈大黃素110795-200605，大黃酸110757-200206，大黃素110756-200110，大黃酚110796-200615，大黃素甲醚110758-200610)。大黃藥材購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房有限公司，由本院李薇教授鑒定為廖科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.干燥根及根莖。

圖1 超聲強化超臨界提取裝置示意圖

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃的預(yù)處理 取大黃飲片，粉碎，過100目篩，混勻，即得。

2.2 大黃蒽醌類成分的提取 參照大黃SFE提取的穩(wěn)定工藝參數(shù)［8］，采用平行試驗的方法，比較超聲、超臨界和超聲強化超臨界的提取效果。

2.2.1 超聲提取(U)［9-10］稱取大黃粉末100.0 g，置1 L萃取釜中，加4 BV乙醇超聲提取2 h(超聲強度:1 000 W，間歇2 min工作)，從放料口收集乙醇提取液，50℃減壓回收至無乙醇滴出，得萃取物。

2.2.2 超臨界提取(SFE)［5，8］稱取大黃粉末 100.0 g，置 1 L萃取釜中，按如下條件萃取2 h:夾帶劑乙醇用量2 BV，萃取壓力18 MPa，萃取溫度50℃，分離壓力5 MPa，分離溫度35℃，收集萃取液，50℃減壓回收至無乙醇滴出，得萃取物。

2.2.3 超聲強化超臨界提取(USFE) 稱取大黃粉末100.0 g，置1 L萃取釜中，按如下條件萃取1.5 h:超聲強度:1 000 W，間歇2 min工作，夾帶劑乙醇用量1.5 BV，萃取壓力18 MPa，萃取溫度40℃，分離壓力5 MPa，分離溫度35℃，收集萃取液，50℃減壓回收至無乙醇滴出，得萃取物。

2.3 供試溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 按文獻方法制備［1，11］，即得每1 mL 中含蘆薈大黃素16.133 μg、大黃酸15.601 μg、大黃素 15.092 μg、大黃酚 16.117 μg、大黃素甲醚 8.109 μg 的混合對照溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取上述萃取物0.1 g，置燒瓶中，同藥典大黃藥材含量測定項下方法，自“加8%鹽酸溶液，超聲2 min，再加三氯甲烷10 mL”起同法制備供試液，再用甲醇稀釋10倍，搖勻，濾過，即得。

2.4 色譜條件［1，12］色譜柱:Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，加預(yù)柱;流動相:甲醇 -0.1%磷酸溶液(85∶15);體積流量:1.0 mL/min，柱溫:30 ℃，進樣量:10 μL，檢測波長:254 nm。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照溶液1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μL，注入液相色譜儀，測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品進樣質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。結(jié)果見表1。

2.6 樣品測定 精密吸取上述對照溶液及供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定并計算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，色譜圖見圖2，結(jié)果見表2。

表1 各對照品線性關(guān)系考察結(jié)果

圖2 蒽醌衍生物HPLC測定色譜圖

由表2可知，提取物中蒽醌衍生物量高低:超聲強化超臨界提?。境R界提?。境暡ㄌ崛?提取物中蒽醌衍生物的提取率大小:超聲強化超臨界提?。境暡ㄌ崛。境R界提取。因超聲波提取時溶劑用量較多，提取物得率較高，使其對蒽醌衍生物的提取率有所提高。

試驗表明，超聲強化超臨界流體提取大黃5種蒽醌衍生物的量及提取率均高于單獨的超聲和超臨界提取。

2.7 驗證試驗 上述試驗過程中收集萃取物時發(fā)現(xiàn)萃取物的顏色變化，由褐黃色變?yōu)轷r黃色再變?yōu)榈S色。為探討此現(xiàn)象的原因并驗證超聲強化超臨界提取工藝，進行如下試驗。提取條件:萃取溫度為40℃，提取時間1.5 h，超聲強度1 000 W，夾帶劑乙醇用量為2 BV，每0.5 BV收集萃取物，測定蒽醌衍生物量和提取率。結(jié)果見表3。

表2 不同提取方法對大黃蒽醌衍生物提取效果試驗結(jié)果 (n=2)

表3 不同時段收集萃取物中大黃蒽醌衍生物測定結(jié)果 (n=2)

由表3可知，第2個0.5BV萃取物中的蒽醌衍生物量及提取率最高，第1個0.5BV次之，第3個0.5BV最低。第2個0.5BV萃取物中大黃酚量高達81.638%，如果欲制備高含量的有效部位，可以采取分段收集的方法。

3 結(jié)論與討論

3.1 試驗結(jié)果表明，USFE的合適萃取溫度、萃取時間和夾帶劑用量分別低于SFE的10℃、30 min、0.5 BV，在相同的萃取壓力下，USFE對5種蒽醌衍生物成分的提取率較SFE分別提高2.113%～6.095%。超聲強化超臨界流體提取大黃5種蒽醌衍生物的量及提取率均明顯高于單獨的超聲和超臨界提取。

3.2 研究顯示，超臨界提取和超聲波提取技術(shù)在中藥提取分離方面具有廣泛的應(yīng)用前景，兩者的成功聯(lián)用尚未見相關(guān)文獻報道，它對有效成分的提取純化和制劑工藝研究具有巨大的推動作用，也為其他的中藥產(chǎn)品工藝改進提供新的方法。

3.3 超聲強化超臨界流體提取技術(shù)成功整合了兩者在提取方面的優(yōu)勢，避免了兩者的劣勢，減少夾帶劑的用量，降低回收工作量及成本，避免萃取物中的有效成分長時間加熱而被破壞，同時縮短提取時間，提高工作效率。

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