日本毛連菜水洗部位降血糖、調(diào)節(jié)血脂作用研究

席嘯虎，葛 睿，高建平

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001

日本毛連菜（Picris japonica Thunb.）為菊科二年生草本植物，全草入藥，又名羊下巴、毛柴胡[1]。據(jù)《中華本草》記載，日本毛連菜具有理肺止咳、化痰平喘、寬胸理氣之功效，民間口服日本毛連菜防治糖尿病。由于西藥的刺激性，國內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)越來越多的中藥降糖藥，但大多都以總提物入藥[2-3]，進(jìn)一步尋找具有降血糖作用的有效部位并明確其化學(xué)成分，有利于藥物劑型的改進(jìn)、劑量的控制[4-6]。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究基礎(chǔ)上，采用腎上腺素致小鼠生理性高血糖,以及四氧嘧啶致小鼠糖尿病等模型，篩選日本毛連菜水洗部位的給藥劑量，并且對其化學(xué)成分進(jìn)行分析及含量測定，同時初步探討其在調(diào)節(jié)血脂水平方面的作用。

1 材料與方法

1.1 藥材、藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)用日本毛連菜采自山西省婁煩縣，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授鑒定為菊科毛連菜屬二年生草本植物日本毛連菜（Picris japonica Thunb.），蠟葉標(biāo)本存放于山西醫(yī)科大學(xué)中藥標(biāo)本室。四氧嘧啶（美國Sigma公司）；葡萄糖試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：102401.201010）；總膽固醇試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：101051.201007）；三酰甘油試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：104101.201008）；高密度脂蛋白試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：100361）低密度脂蛋白試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：100271）；格列本脲（天津力生制藥股份有限公司，批號：1003013）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080.200707）；其余所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠，體重18～22 g，清潔級，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。本實(shí)驗(yàn)所有動物飼養(yǎng)條件一致，開始實(shí)驗(yàn)前3 d置本實(shí)驗(yàn)室觀察飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，各組飼料與飲用水來源均相同。

1.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；752紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；離心機(jī)LXJ-IIB（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子天平BS-124S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 日本毛連菜水洗脫組分的制備 稱取日本毛連菜100 g，加15倍的水回流提取2次，每次1 h，4層紗布過濾，合并濾液，減壓濃縮至100 ml，濃縮液經(jīng)400 g D101大孔吸附樹脂分離，用4倍柱體積的蒸餾水洗脫，洗脫液濃縮至100 ml，搖勻，即得。

1.4.2 對四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖及血脂的影響 小鼠尾靜脈注射新鮮配制的四氧嘧啶50 mg/kg造成糖尿病模型，72 h后，對禁食不禁水的小鼠眼眶后靜脈叢采血，測血糖值，選取空腹血糖高于11.1 mmol/L的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。取合格模型小鼠50只，隨機(jī)分為5組，格列本脲組（10只），日本毛連菜水洗部位低、中、高劑量組（每組各10只），糖尿病模型組，另取重量相近的正常小鼠作為正常組（10只）。連續(xù)給藥14 d后，于末次給藥前小鼠禁食不禁水8 h，給藥后繼續(xù)禁食不禁水后2 h，摘眼球取血，測定各組的空腹血糖值、總膽固醇含量、三酰甘油含量、高密度脂蛋白含量、低密度脂蛋白含量。

1.4.3 對腎上腺素致糖尿病小鼠血糖的影響 取合格昆明種小鼠60只（雌雄各半），隨機(jī)分為6組，日本毛連菜水洗部位低、中、高劑量組（每組10只）和格列本脲組（10只）劑量同“1.4.2”，模型組（10 只）和正常組（10 只）灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。于末次給藥前小鼠禁食不禁水8 h，給藥后繼續(xù)禁食不禁水6 h后，除對照組外，每只小鼠腹腔注射腎上腺素0.2mg/kg，正常對照組則腹腔注射等容量生理鹽水。30 min后，眼眶后靜脈叢采血，測定各組的空腹血糖值。

1.4.4 日本毛連菜水洗部位成分分析 將日本毛連菜水洗部位配制成1 g生藥材/ml的供試品溶液，分別取1 ml用于各類成分的檢測：生物堿檢查，加6滴1%的鹽酸，再加3滴生物堿沉淀劑；酚、醌類檢查，加1滴1%三氯化鐵溶液；內(nèi)酯類檢查，加入1%氫氧化鈉溶液，在沸水中反應(yīng)4 min之后，加2滴鹽酸溶液；甾萜類檢查，溶液蒸干后用酸酐溶解，加入1滴濃硫酸；多糖類檢查，Molish反應(yīng)；皂苷類檢查，香草醛-濃硫酸試液；黃酮類檢查，采用NaNO3-AlNO3-NaOH系統(tǒng)。

1.4.5 日本毛連菜水洗脫部位總黃酮含量測定 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品18.60 mg，用60%的乙醇（V/V）配制成0.186 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml， 各加 60%乙醇至5.0 ml，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 ml，6 min后加10%的硝酸鋁溶液0.3 ml，6 min后加4%的氫氧化鈉溶液4.0 ml，加蒸餾水定容至10.0 ml，放置15 min，試樣空白作參比，在波長505 nm處測定其吸光度。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)得回歸方程：A＝0.014 6 C-0.006 2（r＝0.999 1），蘆丁在 9.3～93.0 g/ml之間線性關(guān)系良好。精密量取日本毛連菜供試品溶液適量，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色后測定其吸光度，代入回歸方程，計(jì)算總黃酮含量。

1.4.6 日本毛連菜水洗部位總多糖含量測定 精密稱取無水葡萄糖10.4 mg，加水溶解配制成104 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，各加蒸餾水至 2.0 ml，苯酚 1.0 ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸 5.0 ml，搖勻，沸水浴15 min后，冷卻至室溫。在490 nm處測定吸光度值。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，得回歸方程：A=0.015 6 C-0.007 6(r=0.999 4)，葡萄糖在 5.2～52.0 μg/ml之間線性關(guān)系良好。精密量取日本毛連菜總供試品溶液適量，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色后測定其吸光度，代入回歸方程，計(jì)算多糖含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影響

連續(xù)給藥14 d后，日本毛連菜水洗脫物低、中、高劑量組的小鼠血糖值與模型組相比均有顯著性下降（P＜0.05），其低劑量組降糖效果最佳（13.42±2.86）mmol/L，與格列本脲組小鼠血糖值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。追加2個劑量組（0.4 g/kg、0.8 g/kg），連續(xù)給藥 14 d后，各組小鼠空腹血糖值顯著高于1.5 g/kg劑量組（P＜0.05）。見圖1。

表1 日本毛連菜水洗部位對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響（±s）Tab.1 Hypoglycemiceffectofparteluatedbywaterfrom Picrisjaponica Thunb.ondiabeticmiceestablishedbyinjecatofAlloxan(±s)

表1 日本毛連菜水洗部位對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響（±s）Tab.1 Hypoglycemiceffectofparteluatedbywaterfrom Picrisjaponica Thunb.ondiabeticmiceestablishedbyinjecatofAlloxan(±s)

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 劑量（g/kg） 只數(shù)格列本脲組水洗低劑量組水洗中劑量組水洗高劑量組模型組正常組0.002 1.5 3.0 6.0--10 10 10 10 10 10給藥前血糖（mmol/L）23.64±7.97 23.06±7.41 22.98±5.92 23.49±6.81 21.52±6.08#5.78±0.63給藥7d血糖值（mmol/L）13.23±2.08*13.56±1.58*18.52±1.93*16.91±2.03*20.93±4.39#5.87±0.38給藥14 d血糖值（mmol/L）13.51±1.39*13.42±2.86*14.92±2.36*17.24±2.15*19.93±3.01#6.41±0.65

2.2 對腎上腺素致糖尿病小鼠血糖的影響

給藥10 d后，腹腔注射鹽酸腎上腺素，模型組小鼠血糖值顯著高于正常組（P＜0.05）；給藥組小鼠血糖值均顯著低于模型組（P＜0.05）；高劑量組小鼠血糖值最低（7.27±1.23）mmol/L，與格列本脲組沒顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。增加2個劑量組（12 g/kg和 18 g/kg），降糖效果均不及（6 g/kg）劑量組(P＜0.05)，結(jié)果見圖 2。

2.3 對四氧嘧啶致糖尿病小鼠血脂水平的影響

給藥14 d后，與正常組比較，糖尿病組小鼠TC、TG、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05），HDL-C 含量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組小鼠 TG、LDL-C含量顯著下降（P＜0.05），HDL-C 含量顯著升高（P＜0.05）。 見表3。

2.4 日本毛連菜水洗部位成分分析及含量測定

日本毛連菜水洗部位主要含有多糖和黃酮類成分以及少許的酚醌類和皂苷類化合物。多糖和黃酮的含量分別為4 097 mg/100 g生藥材和913 mg/100 g生藥材。

3 討論

3.1 日本毛連菜水洗部位降糖劑量探討

在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)四氧嘧啶致糖尿病小鼠的最佳給藥劑量為實(shí)驗(yàn)用藥的低劑量（1.5 g/kg），因此，繼續(xù)追加了2個低劑量組(0.8 g/kg和0.4 g/kg)，結(jié)果降糖效果均不及1.5 g/kg劑量組；腎上腺素致糖尿病小鼠的最佳給藥劑量為實(shí)驗(yàn)用藥的高劑量（6 g/kg），繼續(xù)追加2個高劑量組(12 g/kg和18 g/kg)，降糖效果均不及6 g/kg劑量組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明日本毛連菜水洗脫部位對于四氧嘧啶以及腎上腺素致糖尿病小鼠模型的最適宜給藥劑量分別為1.5 g/kg和6.0 g/kg。由于劑量的不一致性，初步推測可能是因?yàn)槠鹦У某煞只蛘咦饔玫耐緩讲煌?，其具體的降糖機(jī)制以及藥用成分需要進(jìn)一步探討。

表2 日本毛連菜水洗部位對腎上腺素糖尿病小鼠血糖的影響（±s）Tab.2 Hypoglycemic effect of part eluated by water from Picris japonica Thunb.on diabetic mice established by injection of Epinephrine(±s)

表2 日本毛連菜水洗部位對腎上腺素糖尿病小鼠血糖的影響（±s）Tab.2 Hypoglycemic effect of part eluated by water from Picris japonica Thunb.on diabetic mice established by injection of Epinephrine(±s)

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05

組別 劑量（g/kg）1.5 3.0 6.0 0.002水洗低劑量組水洗中劑量組水洗高劑量組格列本脲組模型組正常組--只數(shù)10 10 10 10 10 10血糖值（mmol/L）10.35±2.08*10.44±1.83*7.27±1.23*7.97±0.65*17.26±0.45#5.50±0.31

表3 日本毛連菜水洗部位對四氧嘧啶糖尿病小鼠血脂的影響（±s）Tab.3 Hypolipidemiceffectofparteluatedbywaterfrom Picrisjaponica Thunb.ondiabeticmiceestablishedbyinjectionofalloxan(±s)

表3 日本毛連菜水洗部位對四氧嘧啶糖尿病小鼠血脂的影響（±s）Tab.3 Hypolipidemiceffectofparteluatedbywaterfrom Picrisjaponica Thunb.ondiabeticmiceestablishedbyinjectionofalloxan(±s)

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 劑量（g/kg）TC（mmol/L）水洗低劑量組水洗中劑量組水洗高劑量組模型組正常組1.5 3.0 6.0--4.18±0.31 4.31±0.27 4.05±0.31 4.17±0.22#2.46±0.25 TG（mmol/L）2.07±0.22*2.63±0.12*2.24±0.10*4.54±0.16#2.04±0.13 HDL-C（mmol/L）1.25±0.16*1.22±0.12*1.32±0.09*0.67±0.10#1.61±0.13 LDL-C（mmol/L）1.12±0.15*1.20±0.13*0.99±0.17*1.32±0.82#1.07±0.08

3.2 日本毛連菜水洗部位調(diào)節(jié)血脂作用探討

糖尿病又稱血脂病，糖尿病患者?？梢娧x紊亂[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日本毛連菜水洗脫物對四氧嘧啶致糖尿病小鼠不僅具有顯著的降血糖作用，而且可以顯著降低糖尿病小鼠TG、LDL-C含量以及升高HDL-C含量，其中以高劑量組在降低糖尿病小鼠低密度脂蛋白的含量方面表現(xiàn)的最明顯[從（1.32±0.82） mmol/L 降至（0.79±0.17）mmol/L）]。

3.3 日本毛連菜水洗部位降糖成分探討

文獻(xiàn)報(bào)道，多糖類物質(zhì)具有降血糖作用，降糖機(jī)制主要為促進(jìn)胰島素的分泌，從而降低血糖值[8]。日本毛連菜水洗部位含有較多的多糖類化合物（4 097 mg/100 g生藥材，占日本毛連菜水洗部位質(zhì)量的73.12%），且降糖效果與格列本脲沒有顯著性差異，初步推測日本毛連菜多糖為降血糖的主要成分之一，但其具體的降糖作用及降糖機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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