李 凈 ,喻 光
1.哈爾濱市胸科醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150056;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬一院,黑龍江齊齊哈爾 161041
腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,占成人顱內(nèi)腫瘤的35%~50%,其中惡性膠質(zhì)瘤約占60%。目前腦膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)切除為主,輔以放療、化療和生物治療等綜合療法,但療效仍不理想[1-2]。HIF-1α是在缺氧條件下,廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,與其相關(guān)的一些基因蛋白產(chǎn)物與腫瘤的血管生成、能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞存活、血管重塑以及血管舒縮反應(yīng)有關(guān)[3],在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。Ki-67是一種細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原,多用于判斷腫瘤的惡性程度,也用于探討細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期與腫瘤生長方式、侵襲方式、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系[4-5]。本文通過對56例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本的免疫組化研究,探討HIF-1α及Ki-67抗原在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、兩者的相關(guān)性及臨床意義。
隨機(jī)選取2007~2010年黑龍江省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本56例。其中,男32例,女24例;平均年齡40.1歲。按照WHO(1993)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn),分為Ⅰ~Ⅳ級,Ⅰ~Ⅱ級為低度惡性,Ⅲ~Ⅳ級為高度惡性。56例患者中,Ⅰ級11例、Ⅱ級23例、Ⅲ級19例、Ⅳ級3例。其中星型細(xì)胞瘤39例,少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤11例,室管膜細(xì)胞瘤3例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤3例。
S-P法免疫組化檢測試劑盒、氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、一抗鼠抗人單克隆抗體HIF-1α及兔抗人單克隆抗體Ki-67均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;多聚-L-賴氨酸溶液、磷酸鹽緩沖液粉劑、抗原修復(fù)液購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;蘇木素溶液。
均經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片5張,S-P免疫組化染色(參照試劑盒操作說明書),DAB顯微鏡下控制顯色,蘇木素溶液復(fù)染,逐級脫水性樹脂封片,OLYMPUS顯微鏡下觀察。
①HIF-1α陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒狀位于胞核或胞質(zhì)主要為核表達(dá)。隨機(jī)觀察5個高倍視野膠質(zhì)瘤細(xì)胞中陽性染色細(xì)胞所占的比例,陽性細(xì)胞數(shù)<1%為陰性(-),陽性細(xì)胞數(shù) 1%~10%為弱陽性(+),11%~50%為中度陽性(++),>50%為強(qiáng)陽性(+++)。②Ki-67蛋白的表達(dá)在細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi),呈棕黃色染色為陽性。采用Ki-67指數(shù)(Ki-67LI)表示細(xì)胞的增殖程度,即高倍鏡(×400)下每個視野數(shù)200個瘤細(xì)胞,計算其陽性細(xì)胞總數(shù)。
采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,應(yīng)用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及Spearsman相關(guān)分析等,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
HIF-1α陽性表達(dá)為細(xì)胞核染色,呈棕黃色或橙黃色,腫瘤壞死區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣表達(dá)明顯高于其他區(qū)域。在56例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的總陽性表達(dá)率為66.07%(37/56),其中低度惡性組Ⅰ~Ⅱ級為50.0%(17/34),高度惡性組Ⅲ~Ⅳ級為90.91%(20/22)。HIF-1α在高度惡性的腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)明顯高于低度惡性者,兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。
表1 HIF-1α在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(例)
Ki-67陽性表達(dá)多數(shù)為細(xì)胞核著色,呈棕黃色,少數(shù)為較弱的細(xì)胞質(zhì)染色。在56例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中總陽性表達(dá)率為62.50%(35/56)。Ki-67指數(shù)分別為低度惡性組Ⅰ~Ⅱ級(5.18±7.65)、高度惡性組Ⅲ~Ⅳ級(20.57±7.83),Ki-67在高度惡性的腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)明顯高于低度惡性者,Ⅰ~Ⅱ級和Ⅲ~Ⅳ級間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。
經(jīng)Spearman相關(guān)分析統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn),二者呈正相關(guān),差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(rs=0.513,P<0.01)。見表3。
缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子,為一種DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體內(nèi),其活性受缺氧因素調(diào)節(jié)[6-7]。其α亞單位(HIF-lα)對HIF-1的功能起決定性作用。Jiang等[6]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞氧濃度降低時,HIF-1α蛋白水平呈指數(shù)增加。腫瘤的特征是腫瘤細(xì)胞的過度生長從而導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量的增加,造成瘤體內(nèi)缺氧環(huán)境的形成。而腫瘤的缺氧狀態(tài)可誘導(dǎo)HIF-1α等細(xì)胞因子釋放,體現(xiàn)為在腫瘤中表達(dá)增加[8]。研究表明HIF-1α細(xì)胞因子過度表達(dá)可以與其下游基因中的共有序列結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上增加VEGF的表達(dá)可以增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性,上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平。在實(shí)體瘤中表現(xiàn)為增加缺氧區(qū)域血管的生成,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的繼續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移,并與腫瘤的細(xì)胞代謝、壞死及放化療抵抗等方面有關(guān)。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果表明HIF-1α因子在腦膠質(zhì)瘤中呈陽性表達(dá),并且隨著腫瘤惡性程度的升高,陽性表達(dá)率升高,在高度惡性組與低度惡性組中表達(dá)的差異有顯著性。在腫瘤壞死區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣表達(dá)明顯,提示在腦膠質(zhì)瘤壞死區(qū)、浸潤邊緣區(qū)瘤體內(nèi)的乏氧情況更加嚴(yán)重;高度惡性的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖快,相對低度惡性的乏氧情況更加嚴(yán)重。
表2 Ki-67在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(±s)
表2 Ki-67在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(±s)
注:Ki-67LI為Ki-67指數(shù)
t Ki-67 LI 5.18±7.65 20.57±7.83組織級別 n 34 22 P值Ⅰ~ⅡⅢ~Ⅳ8.0150.000
表3 HIF-1α的表達(dá)與Ki-67相關(guān)性
Ki-67是細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原。存在細(xì)胞周期的G1、S1、G2、M期,是應(yīng)用廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)志物,其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記,可用于判斷腫瘤的等級、增生程度以及臨床預(yù)后[9]。Ki-67的表達(dá)率超過20%的患者的病死率是其低于20%患者的2.2倍[10]。在本研究中,Ki-67在各級膠質(zhì)瘤中均可見陽性表達(dá),其在高惡性級組別腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)率顯著高于低惡性級別組,說明隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度增加,膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長分裂速度和增殖潛能增加。Ki-67指數(shù)(Ki-67LI)是反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。本研究顯示Ki-67LI與腫瘤惡性度呈正相關(guān)。提示Ki-67可反映膠質(zhì)瘤的增殖狀態(tài)及惡性程度,可作為評價膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)及其判斷腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。
在腦膠瘤中,關(guān)于HIF-1α與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性方面文獻(xiàn)中報道較少。本研究結(jié)果顯示HIF-1α與Ki-67陽性表達(dá)呈正相關(guān),差異具有顯著性。提示HIF-1α可誘導(dǎo)低氧環(huán)境下Ki-67等基因蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的增殖。兩者的詳細(xì)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,HIF-1α可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤血管的形成。Ki-67可作為腦膠質(zhì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物。兩者具有相關(guān)性,共同參與促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性增殖與侵襲性生長。兩者聯(lián)合檢測可作為反映腦膠質(zhì)瘤惡性程度的指標(biāo),并判定腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后,為腦膠質(zhì)瘤患者的治療提供參考。
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