三七內生真菌分離與分子鑒定(I)

張玉潔，和澤高，唐龍山，常 征，陳中堅，張 鐵

(1.文山學院生化系，云南文山663000;2.文山州生物資源開發(fā)研究中心，云南文山663000;3.文山苗鄉(xiāng)三七實業(yè)有限公司技術中心，云南文山663000)

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科人參屬多年生草本植物，是名貴中藥材，是我國特有植物種類。由于對環(huán)境要求的特殊性，三七主要集中分布于云南和廣西。其中，云南是目前公認的三七道地藥材的主產區(qū)，占三七年產量的95%［1－2］。植物內生真菌是生長于植物根、莖、葉等組織的細胞間隙或細胞內的一類真菌，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分。迄今所研究的植物體內均發(fā)現(xiàn)存在內生真菌，少則十幾種，多則幾百種［3］。植物內生菌長期生活在寄主植物體內，并與植物協(xié)同進化，在演化過程中形成了密切的互惠共生關系［4］。內生菌對植物生長發(fā)育和系統(tǒng)演化發(fā)揮重要作用，如促進寄主植物對營養(yǎng)物質的利用［5］、產生激素促進植物生長［6］、提高寄主適應逆境包括抗旱、抗寒、抗鹽堿、耐高溫等的能力［7］、協(xié)助植物抵抗病蟲害［8］、增強植物抗重金屬的能力［9］等。此外，“內共生理論”認為生物次生代謝過程中生化途徑的連續(xù)演化會導致有益物質進入到共生體中。因此，宿主體內的個別內生菌產生與宿主相同或相似的生理活性成分是由于兩者的長期共生關系導致宿主可能將其遺傳物質或信息傳遞給其內生真菌，使之具有與宿主相同或相似的代謝途徑并產生具有相同或類似結構的活性產物［10］。為了研究三七內生菌的生理生態(tài)功能，本文首先對三七內生真菌進行了初步分離和鑒定。

1 材料

三七采自文山縣苗鄉(xiāng)三七實業(yè)有限公司硯山基地，分別采集一年生、兩年生、三年生健康三七共48棵。

2 方法

2.1 內生菌分離純化

內生真菌分離培養(yǎng)基為PDA－抗生素培養(yǎng)基，純化及測試菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。分離方法參考Silvani，et al.，(2008)［11］: 取新鮮健康三七的根、莖、葉，流水沖洗干凈后進行表面消毒處理;處理完畢，在無菌條件下，用滅過菌的手術刀切去表層組織，將中間部分切成約0.5 cm大小接種于PDA培養(yǎng)基上，置25°C培養(yǎng);觀察材料邊緣有菌落長出，將不同的菌落分別挑至PDA培養(yǎng)基中;將菌種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐步進行分離純化，直至得到純化的單菌株。將得到的菌株轉接到PDA斜面培養(yǎng)基保存。

2.2 內生真菌的分子鑒定

將菌種接種到PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～10 d，視菌絲生長速度不同而定。無菌過濾菌絲并取少量置于無菌研缽內，加入適量CTAB(Cetyl Triethyl Ammonium Bromide)徹底研磨，利用CTAB法從新鮮菌絲中提取待測菌株的DNA。以所提DNA為模板利用引物 ITS5(5’－3’:GGAAGTAAAAGTCGTCACAAGG 正向)和 ITS 4(5’－3’:TCCTCCGCT-TATCGATATGC反向，White et al.1990)擴增真菌基因組ITS序列，引物由上海生物工程技術有限公司合成(PAGE純化)。PCR采用 50 μL體系，反應條件:95℃預變性5 min，然后以95℃，1 min、55℃，30 s、72℃，1 min進行25個循環(huán)，72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送上海生物工程公司測序。利用BLAST程序對所測內生真菌ITS序列進行在線同源性比對。

3 結果及分析

3.1 三七內生菌的分離

從健康三七根、莖、葉中分離并經初步形態(tài)歸類得158株不同的內生真菌。

3.2 三七內生真菌的種屬

表1 三七內生真菌種類

對其中92株三七內生菌進行了DNA提取和PCR擴增。根據ITS序列與GenBank中的序列同源性關系，將所得菌種歸類為表1所示19+1個屬。從表中種屬歸類可見三七內生真菌種類多樣性豐富，同時，在植物體內微環(huán)境中，不同的微生物能相互作用，形成一種相對穩(wěn)定的微生物菌群。其中一些是分離頻率高、數(shù)量大的優(yōu)勢種，如鐮孢霉屬、球殼菌屬和炭角屬等;而另一些屬于稀有種，如座堅殼屬(Rosellinia sp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis sp.)、Setophoma sacchari(無中文名)等屬只有1株。三七根莖葉不同部位都分離到多株內生菌，說明內生菌普遍存在于三七各器官中，但內生菌在各器官中的分布差異較大，寄居于莖、葉中的內生菌種類和數(shù)量相對較多，而塊根中的內生菌種類和數(shù)量相對較少。

4 討論

三七內生真菌優(yōu)勢種中只有孢鐮孢菌屬是常見的病原菌，但仍有報道某些孢鐮孢屬真菌屬于內生菌，并可產生抗菌、抗腫瘤活性物質。其它優(yōu)勢菌如毛殼菌屬(Chaetomium sp.)、粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)、光黑殼屬(Preussia sp.)真菌均有報道可作為多種植物病害的生防菌株［12］。其中，毛殼菌屬Chaetomium sp.真菌在自然界廣泛分布，是一類應用前景廣闊的植物病害生物防治菌，不僅能有效地防治多種蔬菜、林木和其它大田作物的病害，還能夠降解木質素等難降解物質［13］。多節(jié)孢屬的多種真菌如樹狀多節(jié)孢、明孢多節(jié)孢等有報道可以產生紫杉醇，指狀節(jié)叢孢菌可以捕食線蟲［14］。植物內生和土壤中粉紅粘帚霉屬具有抵抗多種土傳病害的作用［15］。2008年研究人員對生長在南美洲熱帶雨林中的Ulmo樹中分離到一種粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)，并發(fā)現(xiàn)此真菌能夠直接利用纖維素產生混合烴柴油混合物，是綠色能源的一個全新的發(fā)現(xiàn)，目前正在研究它的生物燃料生產潛力。本研究除從三七中分離得到了與以上內生真菌相似性極高的菌種外，還得到一株與GenBank中已報道的基因序列的相似性僅為82%菌株，認為是一新種。以上研究結果表明，三七內生菌中可培養(yǎng)真菌較為豐富，是潛在的新的微生物菌種資源，具有進一步研究的價值。

［1］ 林景超，張永煜，崔健.我國三七產業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀及前景［J］．藥業(yè)縱橫，2005，(2):18.

［2］ 余育鳳，任祖云.三七產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的對策研究［J］．文山學院學報，2011，(1):110－114.

［3］ Hyde KD.Diversity of ascomycetes on palms in the tropics［M］．In:Biodiversity of Tropical Microfungi.(K.D.Hyde，eds.)．Hong Kong:Hong Kong University Press，1997:141－146.

［4］ Rodriguez RJ.Fungal endophytes:diversity and functional roles.New Phytologist，2009，182:314 －330.

［5］ Mandyam K and Jumpponen A.Seeking the elusive function of the root－colonising dark septate endophytic fungi［J］．Studies in Mycology，2005，53:173 －189.

［6］ Tudzynski B，Sharon A.Biosynthesis，biological role and application of fungal phyto－h(huán)ormones［M］．In:Osiewacz HD，ed.The mycota X.Industrial applications.Berlin，Ger-many:Springer－Verlag，2002:183 －212.

［7］ Jose G.Assessing fungal root colonization for plant improvement［J］．Plant Signaling ＆ Behavior，2009，45:445－447.

［8］ Rodriguez RJl.Stress tolerance in plants via habitat－adapted symbiosis［J］．International Society of Microbial Ecology，2008，2:404 －416.

［9］ Jiang M.The Relationship of Heavy Metal Resistant Endophyte and the Heavy Metal Resistance Ability of Their Host Plants［J］．Journal of Agro － Environment Science，2007，(6):2038－2042.

［10］ Yu H.Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes［J］．Microbiol Res，2010，27:467 － 471.

［11］ Silvani，V.A.，F(xiàn)racchia，S.，F(xiàn)ernández，L.，Pérgola，M.，Godeas，A.A simple method to obtain endophytic microorganisms from field－collected roots［J］．Soil Biology＆Biochemistry，2008，(5):1259 －1263.

［12］ Campanile.Antagonistic activity of endophytic fungi towards Diplodia corticola assessed by in vitro and in planta tests［J］．European Journal of Plant Pathology，2007，117:237－246.

［13］ 程敬麗，阮璐璐，陸一夫，等.內生真菌代謝產物球毛殼菌素 A的液相色譜分析［J］．農藥，2011，(1):43－45.

［14］ 趙凱，平文祥，周東坡.內生真菌發(fā)酵生產紫杉醇的研究現(xiàn)狀與展望［J］．微生物學報，2008，(3):403－407.

［15］ 陶萌，李世東，張擁華.土壤中生防菌粉紅粘帚霉67－1的熒光定量 PCR檢測方法［J］．中國生物防治，2009，(1):35 －40.