拉莫三嗪對戊四唑點(diǎn)燃大鼠模型行為學(xué)及抗氧化指標(biāo)的影響*

梁孝印

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院藥學(xué)部 271000)

癲癇是由大腦神經(jīng)細(xì)胞過度放電引起的一種發(fā)作性腦功能障礙，發(fā)病率約7‰[1]。目前，約有80%的病人可通過藥物控制病情，仍有約20%的病人病情難以控制。長期癲癇發(fā)作常會導(dǎo)致患者氧化應(yīng)激狀態(tài)增加。長期應(yīng)用抗癲癇藥物會引起患者認(rèn)知和行為異常，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能的損傷。拉莫三嗪(Lamotrigine, LTG)為苯三嗪類新一代抗癲癇藥，可有效控制癲癇發(fā)作，還具有一定抗氧化作用[2]。為進(jìn)一步研究LTG的抗癇作用特點(diǎn)及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了LTG對戊四唑點(diǎn)燃大鼠模型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 DL-CJ-1N高性能無菌實(shí)驗(yàn)臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，Morris 迷宮(上海吉量軟件有限公司)，SJ210A勻漿機(jī)(海門其林醫(yī)用儀器廠)，PL602-S電子天平(青島遠(yuǎn)博儀器設(shè)備有限公司)，80-2型離心機(jī)(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，旋渦混勻器 ( 太倉市科教儀器廠 )，772S可見分光光度計(jì) ( 上海精密科學(xué)儀器廠 )，電熱恒溫水浴鍋 ( 天津市泰斯特儀器有限公司 )， BF-2000 M電熱恒溫箱 ( 北京八方世紀(jì)科技技術(shù)有限公司 )。

1.1.2試劑 拉莫三嗪(葛蘭素史克，批號：ZJ0065，臨用前壓碎，溶于生理鹽水備用)，戊四唑(Johnson Mattheg Company，批號：L16185，)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物 wistar大鼠，雌雄各半，共50只，150 ～ 220 g。由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20050017。飼養(yǎng)于尺寸為 30 cm ×15 cm ×15 cm 的實(shí)驗(yàn)籠內(nèi)，每籠5只，溫度20℃ ～ 24℃，濕度40% ～70%，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)均在上午8∶00 ～ 10∶00進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時保持室內(nèi)安靜。

1.2 方法

1.2.1戊四唑(Pentylentrazol, PTZ)大鼠點(diǎn)燃模型制備[3]取40只大鼠，以生理鹽水新鮮配制濃度為1.75%的PTZ溶液，腹腔注射PTZ 35 mg·kg-1(亞驚厥劑量)，注射容積為2 ml·kg-1，隔日1次，共給藥14次。在注射PTZ后觀察1h內(nèi)動物的行為變化，記錄發(fā)作潛伏期、發(fā)作分級和發(fā)作持續(xù)時間。發(fā)作分級按照Ono′s的6級分級法：0級：無驚厥；1級：點(diǎn)頭或頭部抽搐； 2級：全身肌陣攣； 3級：頭部抽搐加前肢陣攣； 4級：陣攣驚厥加后肢站立；5級：跌倒； 6級：全身強(qiáng)直-陣攣驚厥。凡連續(xù)5次出現(xiàn)2級或2級以上記錄的大鼠，即為點(diǎn)燃模型大鼠。停藥1周，再次用相同劑量的PTZ測試，如仍保持在2級以上驚厥發(fā)作的大鼠視為點(diǎn)燃成功大鼠。

1.2.2分組及給藥 取正常大鼠10只及造模成功大鼠30只，分為4組，每組10只，即正常對照組、PTZ模型組、LTG組(25 mg·kg-1) 、卡馬西平陽性對照組( 60 mg·kg-1)。LTG組每日腹腔注射LTG 25 mg·kg-1，卡馬西平陽性對照組每日腹腔注射卡馬西平60 mg·kg-1，給藥容積為10 ml·kg-1，正常對照組與模型組每日腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥32天。

1.2.3PTZ大鼠點(diǎn)燃模型的行為學(xué)觀察 第28天給藥后60 min，除正常對照組之外的各組大鼠均腹腔注射PTZ 35 mg·kg-1，觀察1h內(nèi)大鼠癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間及發(fā)作分級。

1.2.4Morris 水迷宮行為學(xué)檢測(隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn))

第28天PTZ大鼠點(diǎn)燃模型行為學(xué)觀察結(jié)束后，將大鼠分別放入水中自由游泳120 s，使之熟悉環(huán)境，第29日開始Morris 水迷宮行為學(xué)檢測。Morris 水迷宮池壁上標(biāo)有東南西北4 個入水點(diǎn)，將水池等分為4 個象限，目標(biāo)象限的中央放置一圓形隱藏平臺，整個實(shí)驗(yàn)期間位置保持不變，水溫保持 (25 ±1) ℃；實(shí)驗(yàn)期間迷宮外足夠的參照物，且始終保持不變。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動軌跡。實(shí)驗(yàn)前動物自由游泳2 min ，正式實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練1 次，每次60 s，隨機(jī)從東、西、南、北各個入水點(diǎn)選擇一個，將動物面向池壁放入水中，記錄動物尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。如果動物在60 s 內(nèi)未找到平臺，由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺，逃避潛伏期記為60 s。實(shí)驗(yàn)歷時4 d，第1天為訓(xùn)練，后3d 數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)和記憶成績[4]。

1.2.5對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

第32日給藥后60 min，除正常對照組之外的各組大鼠均腹腔注射PTZ 35 mg·kg-1，1 h后各組大鼠以10%水合氯醛(400 mg·kg-1, 腹腔注射)麻醉后斷頭取腦，取大鼠大腦組織塊0.5 g，取預(yù)冷的生理鹽水4.5 ml，400 r·min-1勻漿，制備腦組織勻漿，3000 r·min-1離心15 min，取上清液待測。酶生化法測定大鼠腦組織中蛋白質(zhì)含量、SOD、 GSH、CAT活性及MDA含量。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果表示為，統(tǒng)計(jì)處理采用 SPSS13.0 軟件包和 Execl 軟件。

2 結(jié) 果

2.1 拉莫三嗪對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型的抗癲癇作用

PTZ注射過程中，隨著給藥次數(shù)的增加，大鼠逐漸出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、全身肌陣攣、后肢站立，最終發(fā)生全身性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作伴有跌倒及流涎。PTZ完全點(diǎn)燃的大鼠，有自始至終的發(fā)作過程，其驚厥等級分明，全身強(qiáng)直-陣攣性驚厥十分明顯。拉莫三嗪等治療28天后，各治療組與模型組相比，均可延長癲癇大鼠驚厥發(fā)作潛伏期(P< 0.05)、縮短驚厥持續(xù)時間(P< 0.01)、降低驚厥發(fā)作分級(P< 0.05)。結(jié)果見表1 。

表1 拉莫三嗪對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作分級的影響

注：與PTZ模型組比較，1)P< 0.05，2)P< 0.01

2.2 拉莫三嗪對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型Morris 水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果的影響

PTZ組的逃避潛伏期較正常組明顯延長(P<0.05 )；從29天開始，LTG組與PTZ組比較，其逃避潛伏期縮短(P<0.05)，但同時其逃避潛伏期仍較對照組延長(P< 0.05) ；卡馬西平組和LTG組之間的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LTG組和正常組之間的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2 。

表2 拉莫三嗪對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期的影響

注：1)與正常對照組比較P<0.05，2)與PTZ模型組比較P< 0.05 。

2.3 拉莫三嗪對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

大鼠口服給藥32天后，腦組織中SOD、GSH、CAT活性及MDA含量，各組與正常組相比：SOD、GSH、CAT活性顯著下降，MDA含量顯著升高 (P< 0.05 )。LTG組與模型組相比：SOD、GSH、CAT活性顯著增高， MDA含量顯著降低(P<0.05)。LTG組與卡馬西平組相比：GSH活性顯著增高，MDA含量顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 拉莫三嗪對PTZ大鼠點(diǎn)燃模型腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

注：1)與正常對照組比較，P< 0.05；2)與PTZ模型組比較，P< 0.05；3)與卡馬西平組比較，P< 0.05。

3 討 論

PTZ是一種GABAA受體拮抗劑，不破壞腦組織結(jié)構(gòu)，對大鼠的記憶和運(yùn)動能力無明顯影響，常被用于癲癇動物模型的制備[3]。學(xué)習(xí)、記憶和情感反應(yīng)是大腦的高級機(jī)能，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種測試視空間學(xué)習(xí)能力及記憶能力的常用方法[4]。

癲癇及長期應(yīng)用抗癲癇藥物?？蓪?dǎo)致認(rèn)知功能降低，學(xué)習(xí)能力下降等不良反應(yīng)，影響患者生活質(zhì)量[5]?？拱d癇藥物引起認(rèn)知功能損害的機(jī)制被認(rèn)為是由于其增強(qiáng)了γ-氨基丁酸(GABA)對神經(jīng)傳導(dǎo)的抑制作用[6]。LTG為苯三嗪類的新一代抗癲癇藥，能穩(wěn)定神經(jīng)元膜，阻斷對電壓敏感的鈉通道。其不良反應(yīng)小，安全性高，與血漿蛋白結(jié)合率低，不誘導(dǎo)肝微粒體代謝酶。本研究表明，LTG可有效縮短PTZ點(diǎn)燃大鼠隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)中的平均逃避潛伏期，證明LTG能提高認(rèn)知功能，與國外學(xué)者的研究結(jié)果一致[7]。

認(rèn)知功能降低同時，難控制的的重癥癲癇患者往往存在氧化應(yīng)激狀態(tài)加劇，這也是嚴(yán)重影響癲癇患者生活質(zhì)量的因素之一[8]。本研究表明，PTZ點(diǎn)燃模型大鼠腦組織中SOD、GSH、CAT活性顯著降低，MDA含量明顯升高。而LTG能顯著降低PTZ大鼠點(diǎn)燃模型腦組織中SOD、GSH、CAT活性，降低MDA含量，表明抗氧化可能也是LTG抗癲癇機(jī)制之一。

[1] 賈冬, 齊越, 湛鴻利, 等. 癲癇清片對戊四唑大鼠點(diǎn)燃模型的影響[J].中華中 醫(yī)藥學(xué)刊, 2009,27(2):308 -310.

[2] 陳國俊, 秦衷. 拉莫三嗪對大鼠MCAO/IR模型脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的影響[J]. 腦與神經(jīng)疾病雜志, 1997, 5(6):334 -336.

[3] 余巨明,任惠民,蔣雨.癲癇實(shí)驗(yàn)動物模型[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué), 2004,12(4):412-415.

[4] 張均田. 學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)方法∥徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2002: 826 - 830.

[5] Duncan JS, Thompson PJ.The cognitive consequences of epilepsy. Ann Neurol 2003,54:421-2.

[6] Bcata E, Santana I, Castro G, et al. Cognitive effects of therapy with topiramate in patients with refractory partial epilepsy.Rev Neurol, 2002, 34:737.

[7] Aldenkamp AP, Baker G. A systematic review of the effects of lamotrigine on cognitive function and quality of life. Epilepsy Behav, 2001, 2: 85 - 91.

[8] Sudha K, RaoAV, RaoA. Oxidative stress and anti-oxidants in epilepsy. Clin Chim Acta 2001; 303:19-24