肺積1號(hào)方影響小鼠肺癌移植瘤細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

莊 靜 王明霞 韓娜娜 劉麗娟 卜美玲

(1 濰坊市中醫(yī)院腫瘤科，山東 濰坊 261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院2009級(jí)研究生，山東 濰坊 261041；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)研究生，山東 濟(jì)南 250000)

1 材料與方法

1.1材料 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(Lewis lung carcinoma,LLC)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；近交系C57BL/6小鼠，32只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK(京)-1100-0006；兔抗鼠CyclinD1單克隆抗體購(gòu)自中杉金橋生物有限公司。

1.2方法

1.2.1造模、給藥

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。SPF級(jí)近交系C57BL/6小鼠32只，雄性，6～8周齡，體重(20±2)g，均于右側(cè)腋窩皮下注射Lewis肺癌瘤源小鼠瘤細(xì)胞懸液0.2 ml，建立小鼠移植瘤模型。接種第5天，小鼠腋下均可觸及粟粒大小移植瘤，造模成功率100%，按隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)分為4組：模型組、肺積1號(hào)方小劑量、肺積1號(hào)方中劑量組、肺積1號(hào)方大劑量組，每組各8只。肺積1號(hào)方各組小鼠給藥劑量：低劑量組20 g/kg，中劑量組40 g/kg ，高劑量組80 g/kg(分別相當(dāng)于60 kg 成人臨床用量的5 倍、10倍、20倍), 分別灌胃含生藥1.0 g /m l、2.0 g /m l、4.0 g /m l的中藥混懸液0.4 ml。

模型組：灌服生理鹽水0.4 ml/只，1次/日；

肺積1號(hào)方小劑量組：灌服含生藥1.0 g /m l的中藥混懸液0.4 ml/只，1次/日；

肺積1號(hào)方中劑量組：灌服含生藥2.0 g /m l的中藥混懸液0.4 ml/只，1次/日；

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：自家小女林思言、妻侄女林子玥、表侄兒田澎、同事及朋友孩子柯添愷、施芳瑜等十二三人。其中，六年級(jí)畢業(yè)生6人，初一學(xué)生2人，五年級(jí)4人，遠(yuǎn)在福州的侄兒通過(guò)微信湊個(gè)熱鬧。

肺積1號(hào)方大劑量組：灌服含生藥4.0 g /m l的中藥混懸液0.4 ml/只，1次/日。

連續(xù)用藥14天，停藥1天，接種后第21天頸部脫臼法處死各組小鼠。

1.2.2免疫組化SP法檢測(cè)腫瘤組織CyclinD1表達(dá)

1.2.2.1方法

1)除順鉑組外，各組分別取部分腫瘤組織，10%福爾馬林固定24小時(shí)，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，每一組織塊連續(xù)4 μm切片4張；

2)按試劑盒說(shuō)明書要求，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(A液)50 μl，室溫(20～25 ℃)孵育10 分鐘；

3)熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.1M EDTA抗原修復(fù)液,微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10 分鐘后，重復(fù)1 次，冷卻后PBS洗滌2 次，甩干；

4)PBS 沖洗，3分鐘×3次，甩干。滴加封閉液(B液)50μl 覆蓋，室溫孵育10～15 分鐘。用吸水紙將封閉液吸去，勿洗，滴加50μl 一抗(兔抗鼠CyclinD1單克隆抗體)，4℃過(guò)夜；

5)PBS 沖洗，3分鐘×3次，甩干，滴加二抗-HRP多聚體(C液)50 μl，室溫孵育30分鐘；

6)PBS 沖洗，3分鐘×3次，DAB 染色；

7)自來(lái)水充分沖洗；

8)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.2.2結(jié)果判定 以細(xì)胞核被染成棕黃色為陽(yáng)性。

用試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照片(人乳腺癌標(biāo)本)作陽(yáng)性對(duì)照，PBS液取代一抗作陰性對(duì)照。運(yùn)用計(jì)算機(jī)顯微圖像分析技術(shù)進(jìn)行定量分析。在Eclipse E800型光學(xué)顯微鏡下, 每一張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，采用SpotAdvanced顯微攝像系統(tǒng)拍攝照片，并用Image-pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)CyclinD1陽(yáng)性染色的平均光密度值(mean optical density, MOD)進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

CyclinD1抗原的陽(yáng)性表達(dá)定位于移植瘤細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色。與模型組比較，肺積1號(hào)方中劑量組及大劑量組CyclinD1的表達(dá)明顯降低(P<0.01) (見(jiàn)表1)。

表1 免疫組化法檢測(cè)肺積1號(hào)方對(duì)CyclinD1表達(dá)的影響

注：與模型組比較，**P<0.01

3 討 論

CyclinD是G1期主要的細(xì)胞周期蛋白，選擇性的與CDK4或CDK6組成CyclinD- CDK4/6復(fù)合體，可使本來(lái)低磷酸化的Rb蛋白(retinoblastoma protein, 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白)磷酸化，Rb蛋白被磷酸化后，不能繼續(xù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F被釋放而有活性，RNA轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行，促進(jìn)DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。由此可見(jiàn)，CyclinD可以正向調(diào)控細(xì)胞周期，對(duì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用[3]。

Cyclin D有D1、D2、D3三種。CCND1是一種原癌基因，其編碼的Cyclin D1蛋白在正常組織中低水平表達(dá)，而在多種腫瘤中呈過(guò)度表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。Reissmann等[4]在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中檢測(cè)到CCND1基因擴(kuò)增和Cyclin D1蛋白的過(guò)表達(dá)，且多出現(xiàn)在病程早期。梁瑞韻等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白過(guò)度表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且表達(dá)陽(yáng)性者生存期縮短。肖海勵(lì)等[6]發(fā)現(xiàn)，CyclinD1的表達(dá)程度與非小細(xì)胞肺癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、性別、組織學(xué)類型無(wú)關(guān)。

本次研究發(fā)現(xiàn)，肺積1號(hào)方能夠降低Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織CyclinD1的表達(dá)，推測(cè)其抗腫瘤機(jī)理可能是CyclinD1濃度下降后不足以激活CDK4或CDK6，不能形成相應(yīng)的Cyclin-CDK復(fù)合體，Rb蛋白保持低磷酸化或去磷酸化狀態(tài)，結(jié)合的E2F得不到釋放，從而阻礙了E2F介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞周期停滯在G1-S節(jié)點(diǎn)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。降低CyclinD1的表達(dá)，可以改善非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后，課題組將進(jìn)行進(jìn)一步臨床研究。

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