大腸桿菌SOD高產(chǎn)菌的誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

丁林

(沈陽化工大學環(huán)境與生物工程學院，遼寧沈陽110142)

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase簡稱SOD，EC 1.15.1.1)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種金屬酶，在生物體內(nèi)作為一種超氧化物陰離子清除劑而起著重要的作用.超氧陰離子與人類及動植物的機體衰老、腫瘤發(fā)生和自身免疫性疾病等有關(guān)，由于SOD能專一清除超氧陰離子，因此，它可以防御超氧陰離子的毒性，維持細胞正常的生理代謝，對機體具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高免疫力等保護作用，被專家稱為21世紀最有前途的藥用酶.在醫(yī)藥、食品、日化產(chǎn)品等領(lǐng)域有著非常廣泛的應用前景［1－3］.

目前SOD產(chǎn)品主要從動物血液及臟器中提取，容易受原料價格和血源外源性感染的非安全性等因素限制，無法大量生產(chǎn)和被廣泛使用.而微生物資源豐富，易于大量培養(yǎng)，還可通過選育優(yōu)良菌種來提高產(chǎn)酶率［4］，是生產(chǎn)SOD的最好原料.國內(nèi)外有關(guān)微生物SOD研究報道較多的是酵母菌、霉菌，而有關(guān)細菌SOD的研究報道較少［5－6］.紫外線誘變育種是常用的育種方法，具有簡便、快速和高效的特點，是菌種選育中最常采用的技術(shù)手段.故本文以大腸桿菌為出發(fā)菌株，通過紫外線誘變育種篩選出SOD高產(chǎn)菌株，以該菌株作為目的菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)制備SOD，并對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化.旨在為生產(chǎn)SOD提供新原料.

1 材料和方法

1.1 出發(fā)菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)，我院微生物實驗室提供.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20.121℃滅菌20 min.

分離培養(yǎng)基:滅菌的斜面培養(yǎng)基加過氧化氫8 g/L.

種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏6，蛋白胨10，NaCl 5.121℃滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨15，NaCl 5，葡萄糖3.121℃滅菌20 min.

1.3 誘變育種［7］

將活化的出發(fā)菌株接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約6 h).3 000 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用生理鹽水洗滌2次后，制成菌數(shù)約為108個/mL的單細胞菌懸液.取菌懸液4 mL加到直徑6 cm的培養(yǎng)皿(內(nèi)裝攪拌子)內(nèi)，在15 W紫外線下30 cm處振動照射不同時間.

1.4 初篩與復篩

將誘變處理后的菌液在避光下稀釋，取0.1 mL稀釋菌液涂布于平板分離培養(yǎng)基上，用黑紙包好，37℃培養(yǎng)24 h，與未經(jīng)照射處理的作對照，選取生長飽滿的單個菌落編號，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h.取斜面培養(yǎng)物接種于裝發(fā)酵培養(yǎng)基60 mL的250 mL三角瓶中，37℃搖瓶培養(yǎng)12 h，得培養(yǎng)液.然后制得粗酶液，測酶活.按酶活高低作為篩選目的菌株的依據(jù).對目的菌株進行傳代穩(wěn)定性實驗，并對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化.

1.5 酶的提?。?］

將上述得到的培養(yǎng)液，在4℃、12 000 r/min下冷凍離心15 min，收集菌體，稱質(zhì)量，按料液比1∶5(g∶mL)的比例加入pH=7.2的磷酸緩沖液，冰浴下進行超聲波破碎，冷凍離心，上清液即為粗酶液，測定酶活.

1.6 酶活力的測定［9］

用NBT光還原法測定.核黃素在光照時產(chǎn)生氧自由基，可將NBT還原成藍色甲腙(最大吸收波長為560 nm)，而超氧化物歧化酶可清除氧自由基，抑制NBT還原反應.采用抑制50% NBT光還原的酶量為一個酶活單位，酶活力以每小時每克濕菌體的酶活單位數(shù)表示.

1.7 生物量的測定

按1.4操作得培養(yǎng)液，測量培養(yǎng)液體積，冷凍離心后，蒸餾水洗滌菌體，再離心，收集菌體，稱質(zhì)量，計算生物量.

1.8 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

將目的菌株在固體斜面培養(yǎng)基上活化，接入種子培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)12 h，得種子液，備用.

1.8.1 裝液量對產(chǎn)酶影響的實驗

250 mL三角瓶裝入30 mL、60 mL、90 mL、120 mL的pH值為7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基，按2.5%的接種量接入種子液，于37℃搖床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測酶活，確定最佳裝液量.

1.8.2 接種量對產(chǎn)酶影響的實驗

250 mL三角瓶裝液量60 mL，初始pH值為7.2，接種量(體積分數(shù)，以下同)分別為2%、2.5%、3%、3.5%，于37℃搖床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測酶活，確定最佳接種量.

1.8.3 培養(yǎng)基起始pH值對產(chǎn)酶影響的實驗

配制不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌，分別取60 mL裝入250 mL三角瓶中，接種量為2.5%，于37℃搖床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測酶活力，確定最佳起始pH值.

1.8.4 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶影響的實驗

250 mL三角瓶裝液量60 mL，初始pH為7.2，接種量為2.5%，于不同溫度下?lián)u床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測酶活，確定最佳培養(yǎng)溫度.

1.8.5 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響實驗

250 mL三角瓶裝液量60 mL，初始pH為7.2，接種量為2.5%，于37℃搖床培養(yǎng)不同時間，按1.5操作制得粗酶液，測酶活力，確定最佳培養(yǎng)時間.

2 結(jié)果與討論

2.1 SOD高產(chǎn)菌株的選育

2.1.1 SOD高產(chǎn)菌株的篩選

將紫外線誘變處理后的抗過氧化氫菌株，按1.4～1.7操作測酶活和生物量，結(jié)果見表1.

表1 SOD高產(chǎn)菌株的選育結(jié)果Table 1 The results of the breeding of SOD highproducing strain from Escherichia coli

從表1中可以看出:經(jīng)誘變篩選后得到的耐受過氧化氫的菌株的菌體生物量和SOD酶活均高于出發(fā)菌株，其中ECM3菌株最高，酶活比出發(fā)菌株高2.1倍，選用ECM3菌株作為目的菌株進行發(fā)酵條件的研究.

2.1.2 菌株穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

將誘變后篩選得到的目的菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，測菌體生物量和酶活，結(jié)果見表2.由表2可見:目的菌株經(jīng)5次轉(zhuǎn)接傳代，SOD酶活仍比較穩(wěn)定，說明其性狀可以得到穩(wěn)定遺傳.

表2 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Table 2 The results of stability experiments

2.2 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 裝液量對產(chǎn)酶的影響

裝液量對產(chǎn)酶影響的實驗結(jié)果見表3.由表3可知:250 mL三角瓶裝液量60 mL時酶活最高，所以最佳裝液量為60 mL.

表3 裝液量對SOD酶活的影響Table 3 The effect of liquid content on activity of SOD

2.2.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

接種量對產(chǎn)酶影響的實驗結(jié)果見表4.由表4可知:接種量2.5%時酶活最高.所以最佳接種量為2.5%.

表4 接種量對SOD酶活的影響Table 4 The effect of inoculation content on activity of SOD

2.2.3 培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基起始pH值對產(chǎn)酶影響的實驗結(jié)果見表5.由表5可知:起始pH值為7.2時酶活最高.所以最佳起始pH值為7.2.

表5 pH值對SOD酶活的影響Table 5 The effect of pH value on activity of SOD

2.2.4 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶影響的實驗結(jié)果見表6.由表6可知:培養(yǎng)溫度在37℃時酶活力最高.所以最佳培養(yǎng)溫度為37℃.

表6 培養(yǎng)溫度對酶活的影響Table 6 The effect of tempertature on activity of SOD

2.2.5 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶影響的實驗結(jié)果見表7.由表7可知:培養(yǎng)時間16 h酶活力最高.所以最佳培養(yǎng)時間為16 h.

表7 培養(yǎng)時間對SOD酶活的影響Table 7 The effect of fermentation time on activity of SOD

2.2.6 最佳培養(yǎng)條件的重復實驗

在最佳裝液量、接種量、溫度、起始pH和最佳培養(yǎng)時間條件下做3次重復實驗，測定酶活力，結(jié)果見表8.由表8可以看出:最佳發(fā)酵條件下制得的 SOD的酶活力平均值為 4 437.4 (U/g·h)，酶活力最大，重復性很好.

表8 最佳培養(yǎng)條件下的重復實驗Table 8 Repetition test of optimal fermentation condition

3 結(jié)論

采用紫外誘變處理，經(jīng)考察抗過氧化氫能力進行初篩和液態(tài)發(fā)酵測酶活力進行復篩，得到了產(chǎn)SOD較高的目的菌株ECM3.并對該菌株進行了一系列液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到產(chǎn)酶最高的發(fā)酵條件為:250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量2.5%(體積分數(shù))，培養(yǎng)基起始pH值為7.2，培養(yǎng)溫度為37℃，時間為16 h.在此條件下，SOD酶活力為4 435.5 U/g·h.上述結(jié)果對利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD的工業(yè)化具有一定的指導借鑒作用，并為研究大腸桿菌SOD形成的機制提供實驗數(shù)據(jù).

［1］ 李東旭，吳蕾，任云霞.超氧化物歧化酶提取和純化技術(shù)研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29 (3):183－185.

［2］ Shane R W，Radhika S P，Martin C T，et al.Functional Characterization of the Iron Superoxide Diamutase Gene Repertoire in Trypanosoma brucei［J］.Free Radical Biology and Medicine，2006，40(2):198－209.

［3］ Noor R，Mittal S，Iqbal J.Superoxide Dismutase Applications and Relevance to Human Diseases［J］.Med Sci Monit，2002，8(9):210－215.

［4］ 楊明琰，張曉琦，沈儉，等.微生物產(chǎn)超氧化物歧化酶的研究進展［J］.微生物雜志，2004，24(1):49－53.

［5］ 王歲樓，張平之，張欣.從微生物中提取SOD的研究［J］.工業(yè)微生物，1997，27(2):45－47.

［6］ 王偉霞，李福后，呂玲玲，等.高產(chǎn)SOD海洋酵母菌的篩選及其發(fā)酵條件的研究［J］.食品科技，2007，32(5):29－32.

［7］ 劉曉晴.生物技術(shù)綜合實驗［M］.北京:科學出版社，2009:216－219.

［8］ 郭勇.現(xiàn)代生化技術(shù)［M］.廣州:華南理工大學出版社，2001:12－17.

［9］ 程國華.生物化學實驗技術(shù)［M］.沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學出版社，1998:63－64.