嗜熱厭氧梭菌直接發(fā)酵造紙污泥的基本特性*

朱明軍 李平 謝文化

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州510006;2.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州510316)

嗜熱厭氧梭菌(Clostridium thermocellum)是一種嚴(yán)格厭氧的嗜熱革蘭氏陽性菌，其最適生長溫度為55～60℃［1-4］.嗜熱厭氧梭菌能直接以纖維素或微晶纖維素、纖維二糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，并產(chǎn)生乙酸、乳酸、甲酸、氫氣和二氧化碳等副產(chǎn)物.嗜熱厭氧梭菌能產(chǎn)生一種叫纖酶小體的酶復(fù)合體，能有效降解結(jié)晶纖維素，產(chǎn)生葡萄糖供自身細(xì)胞生長代謝.目前的研究表明［3，5-7］，纖酶小體至少包含9個內(nèi)切酶蛋白、4個外切酶蛋白、5個木聚糖酶蛋白、1個幾丁質(zhì)酶蛋白和1個地衣多糖酶蛋白.有趣的是嗜熱厭氧梭菌雖然能產(chǎn)生木聚糖酶，但自身卻并不能利用木糖.纖酶小體各組分通過纖維素結(jié)合域(CBD)與纖維素結(jié)合，通過錨定域與細(xì)胞壁上的腳手架蛋白相聯(lián)，形成纖維素酶復(fù)合體－細(xì)胞的三元有機(jī)整體(CEM)，具有極高的催化效率.早期對C.thermocellum的研究主要集中在發(fā)酵條件控制、底物預(yù)處理等優(yōu)化控制上，但由于其生長產(chǎn)酸導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降，同時自身的酒精耐受性只有1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)左右，其乙醇產(chǎn)量只有0.8～1.2g/L左右［8-10］;之后對其研究主要集中在高酒精耐受株的篩選、纖酶小體的克隆表達(dá)、代謝途徑的控制及生物聯(lián)合加工(CBP)應(yīng)用上.目前已篩選到最高能耐受5%酒精的菌株［11］.Harish 等［12］利用共培養(yǎng)技術(shù)控制pH變化，發(fā)酵預(yù)處理過的香蕉收獲后得到的農(nóng)業(yè)廢棄物，酒精產(chǎn)量最高達(dá)到22g/L.這對于其CBP應(yīng)用來說是個不小的進(jìn)步.

全球能源問題和環(huán)境問題日益嚴(yán)重，利用地球上含量最豐富的纖維素和半纖維素等植物生物質(zhì)資源開發(fā)新能源越來越受到各國政府的重視.嗜熱厭氧梭菌能直接利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，這對于降低成本、簡化生產(chǎn)工藝具有重要意義;其酶復(fù)合體纖酶小體具有典型的熱穩(wěn)定性，具有適用于高熱環(huán)境、易純化、對化學(xué)變性劑有強(qiáng)的抗性、反應(yīng)速率和效率高等優(yōu)點(diǎn)［13］.因此，嗜熱厭氧梭菌被認(rèn)為是纖維素酒精集成生物工藝中最有前景的菌株之一.造紙污泥難處理易污染環(huán)境，目前通常采用填埋法和焚燒法進(jìn)行處理，其中的纖維素和半纖維素并沒有得到有效利用.目前對造紙污泥的有效利用的研究較少，江丹等［14］研究了酶解造紙污泥發(fā)酵燃料乙醇的規(guī)律.本研究以造紙污泥為原料，利用嗜熱厭氧梭菌在不預(yù)處理和不加酶的情況下直接發(fā)酵造紙污泥，并探討了該發(fā)酵過程中產(chǎn)燃料乙醇及產(chǎn)酶的規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜熱厭氧梭菌(Clostridium thermocellum ATCC 27405)為Dartmouth College Lee R.Lynd教授贈送，保藏于華南理工大學(xué)發(fā)酵工程研究室.

1.2 原料及試劑

所有試劑均為分析純，纖維素和二鹽酸吡哆胺購于上海生工生物工程有限公司，纖維二糖購于廣州齊云生物科技有限公司，其它試劑購自天津科密歐試劑有限公司.漿板紙、化學(xué)制漿污泥(含纖維素57.60%，半纖維素13.41%，灰分13.00%)及脫墨污泥(含纖維素11.90%，半纖維素3.90%，灰分44.00%)來自廣東某造紙廠.

1.3 培養(yǎng)基及血清瓶培養(yǎng)

主要成分為A、B、C、D、E 液，分開配制，分裝于100 mL血清瓶中，抽真空并充0.04 MPa的氮?dú)猓?15℃滅菌20 min(E液濾菌).培養(yǎng)基5種成分按體積比45∶2∶1∶1∶1 用無菌注射器混合.A 液為菌體生長所需的碳源，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整，本研究中為不同濃度的纖維二糖、商業(yè)纖維素及造紙污泥等原料.B液:檸檬酸三鉀鹽50.00g/L、一水檸檬酸31.25g/L、硫酸鈉25.00g/L、磷酸二氫鉀25.00 g/L、碳酸氫鈉62.50g/L.C 液:氯化銨75g/L、尿素250g/L、酵母抽提物50g/L.D液:六水氯化鎂50g/L、四水氯化亞鐵5g/L、二水氯化鈣10g/L、一水半胱氨酸鹽酸50g/L.E液:二鹽酸吡哆胺1.0g/L、對氨基苯甲酸0.2g/L、D-生物素0.1g/L、維生素B120.1g/L、維生素B10.2g/L.

將培養(yǎng)基用無菌注射器在100 mL血清瓶中混合，裝液50mL，接種量為10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，在搖床(上海智誠ZHWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器)上于55℃、150r/min的條件下培養(yǎng)24h作為種子液.

1.4 細(xì)胞生長的測定

若培養(yǎng)基以纖維二糖為碳源，則使用Genesys 10 VIS型直插式分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)在600 nm處測定裝有菌液的西林瓶(直徑2cm)的吸光值.

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物及纖維二糖、木糖含量的測定

每12h取一次樣，1.9mL樣品加入0.1mL 10%的硫酸，12000g離心5min，再用0.22 μm微孔濾膜過濾.使用Waters 2695高效液相色譜儀檢測，色譜柱為Biorad公司的HPX-87H柱，柱溫60℃;流動相為去離子水配制的2.5mmol/L的硫酸溶液，流動相流速為0.6mL/min;檢測器為Waters 2414示差折光檢測器，檢測器溫度為40℃.

1.6 粗酶液的制備

搖瓶或發(fā)酵罐在不同的時間點(diǎn)取樣，將樣品在4℃、3000g下離心10min，上清液即為粗酶液，用于酶活測定.

1.7 纖維素酶酶活定義及活性測定

據(jù)纖維素酶制劑輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) (QB2583—2003)并將反應(yīng)溫度修改為55℃測定樣品的纖維素酶酶活.

濾紙酶活的定義:1mL粗酶液在55℃、指定pH條件下水解濾紙底物1h，產(chǎn)生相當(dāng)于1mg葡萄糖的還原糖量為1個酶活單位 (U).羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)酶活定義:1 mL粗酶液在55℃、指定pH條件下水解CMC-Na底物1 h，產(chǎn)生相當(dāng)于1mg葡萄糖的還原糖量為1個酶活單位(U).

1.8 木聚糖酶酶活的定義及活性測定

取1.5mL pH=6.0的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液配制的1%木聚糖溶液，加入0.5mL的粗酶液，于55℃反應(yīng)30min，立即加入3mL的3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，沸水浴中顯色10 min，迅速冷卻后，用蒸餾水定容到25mL，充分混勻，于波長540nm處以對照組空白測定吸光值.對照組在沸水浴前加入粗酶液并迅速煮沸.

木聚糖酶酶活定義:1 mL粗酶液在55℃、指定pH條件下水解木聚糖底物1min，產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol木糖的還原糖量為一個酶活單位(U).

1.9 反應(yīng)器培養(yǎng)方法

反應(yīng)器培養(yǎng)在Sartorius Stedim Biostat A plus全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行.分別采用不同的底物配制A液，滅菌后再泵入B、C、D、E液，通入流速為10 L/h的高純氮?dú)饧s1 h制造厭氧環(huán)境，接種量為10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，裝液量為1L，控制發(fā)酵罐的各項(xiàng)參數(shù)如下:pH=7.0，200r/min，55℃，繼續(xù)通入的保持厭氧環(huán)境的高純氮?dú)獾牧魉贋?0 L/h.在不同時間點(diǎn)取樣測定發(fā)酵產(chǎn)物以及纖維素酶和木聚糖酶酶活.

1.10 纖維素酶和木聚糖酶的基本特性

以20g/L商業(yè)纖維素為底物，在反應(yīng)器中培養(yǎng)96h并制備粗酶液，按1.7和1.8所述方法，分別在不同溫度及不同pH條件下測定纖維素酶和木聚糖酶的酶活以獲取纖維素酶和木聚糖酶的最適溫度和pH.在最適溫度和pH下，在粗酶液中加入25mmol/L的不同金屬離子并測定纖維素酶和木聚糖酶的酶活以考察不同金屬離子對纖維素酶和木聚糖酶酶活的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的兩種典型碳源對菌種生長及產(chǎn)酶的影響

纖維二糖和纖維素是嗜熱厭氧梭菌的兩種典型的碳源，纖維二糖是可溶性的，而纖維素是不溶性的.本研究分別以1.0、2.5、5.0、10.0、20.0g/L 的纖維二糖和纖維素為碳源，在血清瓶中培養(yǎng)，每24 h取一次樣，其pH和產(chǎn)物含量變化情況如圖1所示.

從圖1可以看出，C.thermocellum在纖維二糖中生長迅速，24h即達(dá)到最大D(600)值，發(fā)酵液中的纖維二糖測定結(jié)果表明，1.0g/L和2.5g/L纖維二糖培養(yǎng)基中剩余的纖維二糖均為0;5.0g/L和10.0g/L培養(yǎng)基中剩余的纖維二糖分別為0.16g/L和4.89g/L，說明C.thermocellum僅能利用約5.0 g/L的纖維二糖，這是因?yàn)镃.thermocellum生長產(chǎn)酸導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降抑制其生長的緣故.將發(fā)酵液進(jìn)行離心分離、細(xì)胞裂解及烘干，2.5g/L纖維素培養(yǎng)基中剩余的纖維素含量為0;5.0g/L纖維素培養(yǎng)基中剩余的纖維素含量為0.24g/L，說明C.thermocellum能利用的纖維素最大質(zhì)量濃度約為5.0g/L.

分別連續(xù)測定了5.0 g/L纖維素和5.0 g/L纖維二糖作碳源時的纖維素酶酶活變化情況，結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出，以5.0 g/L纖維素為底物時的濾紙酶活和CMC-Na酶活比5.0 g/L纖維二糖為底物時的都高.這是因?yàn)镃.thermocellum不需要合成纖維素酶即可直接利用纖維二糖，且纖維二糖還是纖維素酶的抑制劑，因此底物為纖維二糖時纖維素酶酶活會較低.最高木聚糖酶酶活則是5.0g/L纖維二糖為底物時更高，具體原因需進(jìn)一步研究.

圖1 嗜熱厭氧梭菌在不同濃度的纖維二糖和纖維素中的生長曲線Fig.1 Growth curves of C.thermocellum at various concentration of cellobiose and cellulose

圖2 5.0g/L纖維素和5.0g/L纖維二糖血清瓶培養(yǎng)時纖維素酶和木聚糖酶酶活變化曲線Fig.2 Enzyme activity curves of cellulase and xylanase in serum bottles with 5.0g/L cellulose and 5.0g/L cellobiose

2.2 C.thermocellum在發(fā)酵罐中直接發(fā)酵不同纖維素原料的基本特性

從上面的研究可以發(fā)現(xiàn)，C.thermocellum生長產(chǎn)生酸，致使pH下降，當(dāng)pH下降至一定值時生長即停止.發(fā)酵罐能控制pH的變化，對于菌體生長及產(chǎn)物積累有積極作用.

在發(fā)酵罐中以20.0g/L商業(yè)纖維素為底物時，乙醇含量在96h達(dá)到最大值4.17g/L(見圖3(a))，是血清瓶培養(yǎng)時乙醇產(chǎn)量的8.03倍，之后略有下降;乙酸是主要的副產(chǎn)物，最高含量達(dá)到2.55g/L，甲酸和乳酸的含量相對較低，含量最高時分別為0.93g/L和0.63g/L;濾紙酶活在 C.thermocellum生長穩(wěn)定期達(dá)到1.79U/mL，是血清瓶培養(yǎng)時最高酶活的3.53倍，108h(底物消耗完)達(dá)到2.70 U/mL;CMC-Na酶活最高達(dá)到3.92 U/mL，是血清瓶培養(yǎng)時的5.69倍;木聚糖酶酶活最高達(dá)到0.96 U/mL，是血清瓶培養(yǎng)時的3.01倍，結(jié)果表明，反應(yīng)器培養(yǎng)能提高菌體濃度，促進(jìn)產(chǎn)酶.進(jìn)一步提高商業(yè)纖維素含量到40.0g/L，乙醇含量達(dá)到4g/L左右代謝途徑即自動轉(zhuǎn)向乙酸及乳酸代謝途徑;同時酶活變化不大(濾紙酶活、CMC-Na酶活及木聚糖酶酶活最高分別為1.78、3.69及1.01U/mL)，說明單純靠提高底物濃度并不能進(jìn)一步提高產(chǎn)物濃度和酶活.

以20.0g/L漿板紙為底物時，纖維素酶酶活和產(chǎn)物整體變化趨勢與以商業(yè)纖維素為底物時大致相同(見圖3(b))，但最高酶活卻比以商業(yè)纖維素為底物時低，其原因可能是因?yàn)闈{板紙?jiān)谠旒堖^程中經(jīng)過高溫、堿、蒸汽爆破等一系列處理，菌體不需要表達(dá)大量的酶即可利用，所以發(fā)酵液的纖維素酶最高酶活較商業(yè)纖維素作底物時低.木聚糖酶最高酶活與以商業(yè)纖維素為底物時相比略有提高，達(dá)到1.14 U/mL.各種產(chǎn)物也比以商業(yè)纖維素為底物時低，乙醇含量最高只有2.86g/L，甲酸、乙酸、乳酸的峰值含量分別為0.55、0.55和0.34 g/L.造成這種現(xiàn)象的原因尚待進(jìn)一步研究.

圖3 反應(yīng)器中C.thermocellum發(fā)酵商業(yè)纖維素、漿板紙、化學(xué)制漿污泥及脫墨污泥的基本特性Fig.3 Characteristics of C.thermocellum cultured in bioreactor with cellulose，paper pulp，chemical paper sludge，recycled paper sludge as feedstock

造紙污泥是制漿和造紙工業(yè)廢水處理過程的固體殘?jiān)?造紙污泥中一般含有20% ～70%的碳水化合物，其中大約有80%是纖維素和半纖維素［14］，理論上可以被C.thermocellum直接利用.工業(yè)中常見的兩種造紙污泥是化學(xué)制漿污泥和脫墨污泥.C.thermocellum能夠直接利用未經(jīng)任何預(yù)處理的化學(xué)制漿污泥和脫墨污泥(見圖3(c)、(d)).C.thermocellum直接利用化學(xué)制漿污泥(固形物含量為40.0g/L)要經(jīng)過近96h的延遲期，這可能是由于污泥中含有較多的雜質(zhì)和灰分所致.與商業(yè)纖維素為底物發(fā)酵的穩(wěn)定期相比，化學(xué)制漿污泥的穩(wěn)定期的CMC-Na酶活與之相當(dāng)，在3.67 U/mL左右，濾紙酶活提高了10%左右，達(dá)到1.92U/mL.其原因可能是因?yàn)槲勰嗬锏睦w維素被一些雜質(zhì)如泥土、CaCO3包裹著，不容易利用，所以菌體要表達(dá)更多的酶利用污泥.由于所使用的化學(xué)制漿污泥里還含有大約13.41%的半纖維素，能夠誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生更多的木聚糖酶，因而木聚糖酶最高酶活比商業(yè)纖維素作底物時提高了35%，達(dá)到1.30U/mL.化學(xué)制漿污泥的乙醇產(chǎn)量最高為7.41g/L，較以商業(yè)纖維素為底物時的乙醇含量提高了77.9%，但乙酸含量也高達(dá)7.11g/L，乙醇/乙酸質(zhì)量濃度比接近1∶1;與商業(yè)纖維素為底物時相比，化學(xué)制漿污泥為底物時的甲酸含量也有大幅度提高，最高達(dá)到2.22 g/L，乳酸最高含量降低，為 0.58g/L.

脫墨污泥里灰分含量達(dá)到44.00%，以CaCO3和高嶺土為主，同時含有較多的重金屬等雜質(zhì)，對菌體生長及產(chǎn)酶有較強(qiáng)的抑制作用(見圖3(d)).以脫墨污泥為底物(固形物含量為84.0g/L)時最高濾紙酶活只有0.72 U/mL，為以商業(yè)纖維素為底物時的27%;最高CMC-Na酶活為1.64U/mL，是以商業(yè)纖維素為底物時的42%;最高木聚糖酶酶活為0.90U/mL，變化較小.同時產(chǎn)物含量也較低，乙醇最高含量只有1.31g/L，乙酸、甲酸和乳酸最高含量分別為1.55、0.43和0.07 g/L.不同底物對 C.thermocellum的乙酸、甲酸和乳酸3條支路代謝影響較大，其產(chǎn)量的比值差別較大(見表1).以化學(xué)制漿污泥為底物時乙醇產(chǎn)量最高，達(dá)到7.41g/L;以漿板紙和纖維二糖為底物時，乙醇/乙酸質(zhì)量濃度比較高，分別達(dá)到5.23和5.07.

表1 不同底物發(fā)酵產(chǎn)物比較1)Table 1 Comparison of fermentation products cultured in different substrates

2.3 C.thermocellum纖維素酶和木聚糖酶的基本特性

由圖4(a)可知，C.thermocellum纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，酶活是55℃下酶活的1.09倍，溫度低于55℃或超過60℃時酶活迅速下降，65℃和50℃的酶活分別只有55℃的酶活的72.50%和75.17%.商業(yè)纖維素酶通常通過絲狀真菌來生產(chǎn)，其最適溫度通常為50～55℃，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時酶活迅速下降，通常只有最適溫度下的40%左右［15］，因此C.thermocellum纖維素酶耐熱性有較明顯的優(yōu)勢.由圖4(a)還可知，C.thermocellum產(chǎn)木聚糖酶有良好的耐熱性，其最適反應(yīng)溫度為70℃，為55℃條件下酶活的1.52倍，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時，其酶活依然為55℃條件下的1.16倍.通常商業(yè)木聚糖酶來源于真菌或細(xì)菌，最適溫度一般為40～60℃［16］，相比較而言，C.thermocellum木聚糖酶具有較好的耐熱性.

圖4 溫度和pH對纖維素酶和木聚糖酶酶活性的影響Fig.4 Effects of temperature and pH on cellulase and xylanase activity

由圖4(b)可知，C.thermocellum產(chǎn)纖維素酶的最適pH值為5.5左右，pH下降對酶活影響較大，pH=4.5時酶活為pH=5.0時的56.78%，但pH值降到4.0時，酶活只有pH=5.0時的18%，說明該纖維素酶對酸性環(huán)境敏感，這也為低pH條件下菌體幾乎不生長提供了證據(jù).商業(yè)纖維素酶通常分為酸性纖維素酶和中性纖維素酶，前者最適的酶pH值為4.8左右，后者為6.0左右，C.thermocellum產(chǎn)纖維素酶最適pH值為5.5左右，說明該酶與市售的商業(yè)纖維素酶有較大區(qū)別.C.thermocellum產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值為7.0左右，此時酶活為常規(guī)測定方法的1.15倍.該木聚糖酶有著良好的pH適應(yīng)性，在pH=5.5～8.0都能保持96%以上的活性(相對于pH=6.0).

Ca2+是纖維素酶的組成部分，從圖5可以看出，Ca2+并未如報道所述對其酶活有促進(jìn)作用［17］，可能是因?yàn)榇置敢豪锲渌x子的影響.Ba2+對其有明顯的促進(jìn)作用，纖維素酶酶活為空白對照的1.71倍.其余各種離子對纖維素酶都有不同程度的抑制作用，其中Fe3+、Cu2+的抑制作用最強(qiáng)，纖維素酶酶活分別為原來的29.4%和30.6%.有研究表明，一些重金屬元素如Cu2+能影響酶分子的—SH的還原狀態(tài)使之氧化，從而改變酶的構(gòu)象使酶失活［18］.乙二胺四乙酸(EDTA)也對纖維素酶有明顯的抑制作用.

圖5 金屬離子和EDTA對纖維素酶和木聚糖酶酶活的影響Fig.5 Effects of metallic ions and EDTA on cellulase and xylanase activities

Ca2+也未對木聚糖酶酶活產(chǎn)生明顯的促進(jìn)或抑制作用，F(xiàn)e3+對木聚糖酶酶活促進(jìn)作用最強(qiáng)，為空白對照的1.99倍，其次是Al3+，為空白對照的1.63倍.Mn2+和EDTA對木聚糖酶酶活抑制作用較明顯，酶活分別為空白對照的61.96%和59.56%.如圖5所示的其它幾種離子對木聚糖酶酶活都有不同程度的促進(jìn)作用，木聚糖酶展現(xiàn)了良好的適應(yīng)性.

3 結(jié)論

C.thermocellum能產(chǎn)生纖酶小體直接利用未經(jīng)任何預(yù)處理的造紙污泥發(fā)酵產(chǎn)乙醇，反應(yīng)器培養(yǎng)時最高乙醇產(chǎn)量達(dá)到7.41 g/L.不同底物對其代謝產(chǎn)物和纖酶小體的主要成分纖維素酶及木聚糖酶酶活也有影響.其纖維素酶最適溫度為60℃，最適pH值為5.5;木聚糖酶的最適溫度為70℃，在pH=5.5～8.0范圍內(nèi)都展現(xiàn)了良好的適應(yīng)性.下一步研究的方向是通過基因工程手段敲除C.thermocellum的其它代謝支路提高乙醇含量以及將纖酶小體組分在其它生長周期短的菌種里進(jìn)行表達(dá).

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